Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct
Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes d’activité signalisation TGF-β/Smad3 utilisant un système de reporter des adénovirus. Ce système suit l’activité transcriptionnelle en temps réel et peut être appliqué à ces deux cellules isolées in vitro et dans l’animal vivantmodèles.
Abstract
Transforming Growth Factor β (TGF-β) signalisation réglemente plusieurs fonctions importantes requises pour l’homéostasie cellulaire et se trouve souvent surexprimé dans de nombreuses maladies, y compris le cancer. TGF-β est fortement impliqué dans les métastases au cours de la progression tardive stade du cancer, activant un sous-ensemble de cellules tumorales migrateurs et envahissantes. Les méthodes actuelles d’analyse de la voie de signalisation se concentrent sur des modèles de point de terminaison, qui souvent tentent de mesurer la signalisation post-hoc de l’événement biologique et ne reflètent pas la nature progressive de la maladie. Ici, nous démontrons un adénovirus roman journaliste système spécifique pour la voie de signalisation TGF-β/Smad3 pouvant détecter l’activation de la transcription dans des cellules vivantes. Utilisant un journaliste Ad-CAGA12-Td-Tom , nous pouvons atteindre un taux de 100 % d’infection des cellules MDA-MB-231 dans 24h in vitro. L’utilisation d’un reporter fluorescent permet pour l’imagerie de cellules vivantes d’unique en temps réel avec une identification directe des cellules transcriptionnellement actives. La stimulation des cellules infectées avec le TGF-β affiche uniquement un sous-ensemble de cellules qui sont transcriptionnellement actif et impliqué dans des fonctions biologiques spécifiques. Cette approche permet de grande spécificité et sensibilité à un niveau de cellule unique pour favoriser la compréhension des fonctions biologiques associés à TGF-β signalisation in vitro. Smad3 activité transcriptionnelle peut également être signalés en vivo en temps réel par le biais de l’application d’une Ad-CAGA12– Luc journaliste. Ad-CAGA12– Luc peut être mesurée de la même manière que les lignées traditionnelles luciférase stablement transfectées. Smad3 activité transcriptionnelle de cellules implantées dans vivo peut être analysée par le biais de l’imagerie conventionnelle IVIS et suivie direct au cours de la progression tumorale, donnant un aperçu unique sur la dynamique de la voie de signalisation TGF-β. Notre protocole décrit un système de livraison de journaliste avantageuse permettant l’imagerie haut débit rapide des voies de signalisation de cellules vivantes in vitro et in vivo. Cette méthode peut être étendue à un éventail de tests image basée et présente une approche sensible et reproductible pour biologie fondamentale et développement thérapeutique.
Introduction
Facteur de croissance transformant β (TGF-β) est une cytokine essentiel impliqué dans le développement humain qui signale par un hétérodimère complexe composé de type II et récepteurs1de type I. Liaison au récepteur II de type résultats dans le recrutement et la phosphorylation de type I du récepteur, qui phosphoryle à son tour en aval Smad2/3 protéines2,3. Ces activé Smad2/3 protéines lié à Smad4, formant un complexe translocation dans le noyau, qui régule la transcription de gène4. Dans des conditions homéostatiques TGF-β/Smad signalisation est étroitement contrôlée ; Toutefois, dans de nombreuses maladies, la voie de signalisation est déréglementée et souvent surexprimé conduisant à la progression de la maladie5,6,7. Des études récentes ont démontré que la réponse cellulaire au TGF-β est hétérogène et sous-populations de cellules actives de TGF-β/Smad sont responsables de la fonction biologique dans une fonction du temps8,9. Commune analyse cellulaire de la signalisation TGF-β/Smad implique l’utilisation de tests de point de terminaison fixe qui fournissent seulement un instantané de l’activité cellulaire et souvent de doser la moyenne TGF-β/Smad effet10. Cependant, ces méthodes, ne représentent pas exactement les comportements moléculaires du TGF-β/Smad signalisation dans l’état physiologique au cours de la progression de la maladie. Analyse de cellules vivantes sur image capture la dynamique des processus biologiques et cellulaires, avec une compréhension à la fois spatiale et temporelle.
Notre objectif était de développer une méthode sensible de haut débit pour l’imagerie de cellules vivantes du TGF-β/Smad de signalisation à l’aide de réactifs à base d’adénovirus. Ici, nous avons infecté la lignée de cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 avec un adénovirus qui exprime l’ordre de liaison Smad3 CAGA motif et une luciférase (Luc) ou le gène rapporteur Td-tomate (Td-Tom). Systèmes de journaliste adénoviraux fournissent une méthode rapide et bon marchée pour l’introduction de plasmide qui peut entraîner un taux de 100 % d’infection en lignées de cellules cancéreuses. Systèmes viraux journaliste ont également été appliquées avec succès aux lignées de cellules qui sont difficiles à transfecter avec plasmide classique11. Dans ce protocole, nous allons décrire un processus reproductible et non invasif pour parvenir à l’imagerie de cellules vivantes de la voie de signalisation de TGFβ/Smad fois in vivo et in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé une technique permettant l’imagerie en temps réel de la signalisation TGF-β/Smad3 dans des cellules vivantes unique. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons déjà identifié une sous-population de cellules avec la dynamique activité transcriptionnelle de TGF-β/Smad3 associée à l’invasion améliorée et migration8. Cette méthode améliore sur les dosages traditionnels pour la signalisation TGF-β, tels que les transferts de western de la phosphorylation S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à H-JZ. TMBW est récipiendaire de la bourse postdoctorale Australie le gouvernement australien et la bourse de recharge Ann Henderson de Australian Health Rotary en partenaire avec le Rotary de Templestowe et Dine d’un remède.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
Referências
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