TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。
Summary
ここでは、TGF-β/Smad3 シグナル伝達活性アデノ ウイルス レポーター システムを使用しての生きているセルイメージ投射のためのプロトコルを提案する.このシステムはリアルタイムで転写活性を追跡し、両方単一細胞の in vitroおよび生きている動物に適用できますモデル。
Abstract
増殖因子 β (TGF-β) シグナル変換生体のホメオスタシスに必要な多くの重要な機能を調節して、一般的に発見がんなど多くの疾患で過剰に発現します。TGF β が強く関与している転移の遅段階の癌の進行中に渡り鳥や侵襲性の腫瘍細胞のサブセットをアクティブにします。シグナル伝達経路解析のための現在の方法はしばしば生物学的イベントのシグナリング事後を測定しようとし、病気の進歩的な性質を反映していないエンドポイント モデルに焦点を当てます。ここでは、TGF-β/Smad3 シグナリングパス生細胞における転写活性化を検出するための新規アデノ ウイルス レポーター システム固有を示します。広告 CAGA12-Td トム記者を活用し、24 時間体外内の MDA MB 231 セルの 100% 感染率を実現できます。蛍光レポーターの使用により、活単一細胞のイメージングの転写活性状態の細胞の直接同定とリアルタイム。TGF-β と感染細胞の刺激が転写活性アクティブで、特定の生物学的機能に関与する細胞のサブセットのみが表示されます。このアプローチは高い特異性と単一細胞レベルでの感度の TGF-β シグナリング体外に関連する生物学的機能の理解を高めることできます。Smad3 転写活性することができます報告体内でリアルタイムのアプリケーションを介して、広告 CAGA12– リュック ・記者。広告 CAGA12– リュック伝統的な固定して transfected ルシフェラーゼの細胞と同じ方法で測定することができます。Smad3体内移植細胞の転写活性は従来の IVIS イメージングによる解析でき、TGF-β シグナル伝達経路のダイナミクスにユニークな洞察力を提供すること、腫瘍の進行中にライブ モニターします。我々 のプロトコルを記述する生きている細胞のシグナル伝達経路のクイック高速イメージングを可能にする有利な記者配信システムの in vitroとin vivoの両方。このメソッドは、イメージ ベースのアッセイや基礎生物学と治療開発のため高感度で再現性のあるアプローチとして提示の範囲に拡張できます。
Introduction
トランスフォーミング増殖因子 β (TGF-β) は、信号をヘテロ二量体複合体 II 型を介して人間の開発に関与している重要なサイトカイン受容体1型します。募集およびタイプのリン酸化のタイプ II の受容体に結合結果 I 受容体は、順番に下流 Smad2/3 タンパク質2,3を廃止します。これらは核に移行し、4遺伝子の転写を調節する複合体を形作る Smad4 へ Smad2/3 蛋白質のバインドを活性化。TGF-β/Smad の恒常条件下で信号が堅く調整される;ただし、多くの病気のシグナル伝達経路は自由化は、しばしば病5,6、7の進行につながる過剰に発現します。最近の研究は、TGF β 細胞応答が異種 TGF-β/Smad アクティブな細胞の集団は、時間依存的8,9の生物学的機能を実証しています。TGF-β/Smad シグナリングの一般的な細胞解析は、細胞の活動のスナップショットのみを提供し、しばしば平均 TGF-β/Smad 効果10量的に表わす固定エンドポイント アッセイの使用を含みます。これらのメソッドは、ただし、可能性があります正確に表していない TGF-β/Smad は病気の進行時生理状態の伝達の分子の挙動。生きているセルのイメージ ベース解析は、時空の理解の両方の細胞および生物学的プロセスのダイナミクスをキャプチャします。
私たちの目標は、TGF-β/Smad アデノ ウイルス ベースの試薬を用いるシグナリングの生きているセルイメージ投射のための高感度ハイスループット法を開発することでした。ここでは、我々 感染ひと乳癌癌セルライン MDA MB 231 Smad3 CAGA モチーフ バインド シーケンスとルシフェラーゼ (リュック) または Td トマト (Td トム) レポーターの遺伝子を表現するアデノ ウイルス。アデノ ウイルス レポーター システムは、癌細胞株における 100% 感染率につながるプラスミド導入クイックで安価な方法を提供します。アデノ ウイルス レポーター系も正常に従来のプラスミド11transfect に困難細胞に適用されています。このプロトコルでは TGFβ/Smad のシグナル伝達経路の生きているセルイメージ投射を達成するために、再現性と非侵襲的プロセスを述べる体内と体外の両方。
Protocol
Representative Results
Discussion
TGF-β/Smad3 は単一生細胞におけるシグナル伝達のリアルタイム イメージングを可能にする技術を開発しました。この手法を使用すると、動的の TGF-β/Smad3 転写活性強化された侵入および移行8に関連付けられていたと以前セルのサブ人口を同定しました。このメソッドが TGF-β シグナル、Smad3 リン酸化の西部のしみなどの伝統的なアッセイに向上し、TGF-β は、不均一性をキャ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は H JZ に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの助成金によって支えられました。TMBW は、Templestowe ロータリーと治療のための食事のパートナーにオーストラリア政府からオーストラリア大学院賞、オーストラリアのロータリー健康からアン ヘンダーソン トップアップ奨学金の受信者であります。
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
Referências
- Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
- Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
- Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
- Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
- Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
- Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
- Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
- Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
- Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
- Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
- Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
- Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
- Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
- Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
- Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
- Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
- Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
- Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
- Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
- MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
- Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
- Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
- de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
- Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
- Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
- Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
- Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).
