Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad3 Signalisierung Aktivität mit einem Adenovirus-Reporter-System. Dieses System verfolgt transkriptionelle Aktivität in Echtzeit und kann angewendet werden, um sowohl einzelne Zellen in Vitro und in lebenden TierenModelle.
Abstract
Transforming Growth Factor β (TGF-β) Signalisierung regelt viele wichtige Funktionen, die für die zelluläre Homöostase erforderlich und wird im allgemeinen gefunden in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs überexprimiert. TGF-β ist stark in Metastasen während späten Stadium Krebs Fortschreiten, impliziert eine Teilmenge der Zugvögel und invasive Tumorzellen zu aktivieren. Aktuelle Methoden zur Signalisierung Pathway Analyse konzentrieren sich auf Endpunkt-Modelle, die oft versuchen, Signalisierung Post-hoc- des biologischen Ereignisses zu messen und spiegeln nicht die progressive Natur der Krankheit. Hier zeigen wir eine neuartige Adenovirus Reporter System speziell für die TGF-β/Smad3 Signalweg, die transkriptionelle Aktivierung in lebenden Zellen erkennen kann. Mit Hilfe eines Ad-CAGA12-Td-Tom -Reporter, erreichen wir eine 100 %-Infektionsrate von MDA-MB-231 Zellen innerhalb von 24 h in Vitro. Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter ermöglicht für die Darstellung von live Einzelzellen in Echtzeit mit direkten Identifizierung von transcriptionally aktiven Zellen. Stimulation der infizierten Zellen mit TGF-β zeigt nur einen Teil der Zellen, die transcriptionally aktiv und spezifischen biologischen Funktionen beteiligt sind. Dieser Ansatz ermöglicht hohe Spezifität und Sensitivität auf eine einzelne Zellenebene das Verständnis biologischer Funktionen im Zusammenhang mit TGF-β Signalisierung in Vitrozu fördern. Smad3 transkriptionelle Aktivität auch kann berichtet in Vivo in Echtzeit durch die Anwendung eine Ad-CAGA12– Luc Reporter. Ad-CAGA12– Luc in der gleichen Weise wie herkömmliche stabil transfizierten Luciferase-Zell-Linien gemessen werden. Smad3 transkriptionelle Aktivität der implantierten Zellen in Vivo werden durch konventionelle IVIS Bildgebung analysiert und live während der Tumorprogression, einzigartige Einblicke in die Dynamik der TGF-β-Signalweg überwacht. Unser Protokoll beschreibt eine vorteilhafte Reporter-Delivery-System ermöglicht schnelle Hochdurchsatz-Bildgebung live Zelle Signalwege in Vitro und in Vivo. Diese Methode kann zu einer Reihe von bildbasierte Assays und Geschenke als sensibel und reproduzierbare Ansatz für grundlegende Biologie und therapeutische Entwicklung erweitert werden.
Introduction
Transforming Growth Factor β (TGF-β) ist eine wesentliche Zytokin verwickelt in der menschlichen Entwicklung, das signalisiert durch ein heterodimerisierenden Komplex bestehend aus Typ II und Typ-I-Rezeptoren1. Bindung an II Rezeptor Typ Ergebnisse bei der Rekrutierung und Phosphorylierung von Typ I-Rezeptor, der wiederum nachgelagerten Smad2/3 Proteine2,3phosphorylates. Diese aktiviert Smad2/3 Proteine binden an Smad4, bilden einen Komplex, der translocates in den Zellkern und reguliert gen Transkription4. Homöostatische Bedingungen TGF-β/Smad-Signalisierung ist streng reguliert; jedoch bei vielen Krankheiten der Signalweg ist dereguliert und häufig überexprimiert führende bis zum Fortschreiten der Erkrankung5,6,7. Jüngste Studien haben gezeigt, dass zelluläre Reaktion, TGF-β heterogen ist und Subpopulationen von TGF-β/Smad aktiven Zellen verantwortlich für die biologische Funktion in einem Zeit-abhängigen Weise8,9 sind. Gemeinsame zelluläre Analyse der TGF-β/Smad-Signal beinhaltet die Verwendung von festen Endpunkt-Assays, die bieten nur einer Momentaufnahme der Zellaktivität und oft quantitate die durchschnittliche TGF-β/Smad-Effekt10. Diese Methoden können jedoch nicht genau die molekulare Verhalten der TGF-β/Smad-Signal in den physiologischen Zustand während der Progression der Erkrankung darstellen. Image-basierte Analyse von lebenden Zellen erfassen die Dynamik zellulärer und biologische Prozesse mit einem räumlichen und zeitlichen Verständnis.
Unser Ziel war es, eine empfindliche Hochdurchsatz-Methode für das live Cell Imaging der TGF-β/Smad Signalisierung mit Adenovirus-basierte Reagenzien zu entwickeln. Hier infiziert wir die menschliche Brust-Krebs-Zell-Linie MDA-MB-231 mit ein Adenovirus auszudrücken Smad3 CAGA Motiv Bindung Sequenz und eine Luciferase (Luc) oder Td-Tomate (Td-Tom) Reporter-gen. Adenoviralen Reporter-Systeme bieten eine schnelle und billige Methode für Plasmid-Einführung, die eine 100 %-Infektionsrate in Krebs-Zell-Linien führen können. Adenoviralen Reporter Systeme wurden auch erfolgreich auf Zell-Linien angewendet, die schwer mit herkömmlichen Plasmid11transfizieren sind. In diesem Protokoll beschreiben wir ein reproduzierbar und nicht-invasive Verfahren zur live Cell Imaging von TGFβ/Smad-Signalweg zu erreichen in Vivo und in Vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwickelten eine Technik, um Echtzeit-Bildgebung der TGF-β/Smad3 Signalisierung im einzigen lebenden Zellen zu ermöglichen. Mit dieser neuartigen Methode haben wir zuvor eine Subpopulation von Zellen mit dynamischen TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität identifiziert, die mit verstärkten Invasion und Migration8verbunden war. Diese Methode verbessert auf traditionelle Assays für die TGF-β-Signalisierung, wie westliche Flecken der Smad3 Phosphorylierung und TGF-β gezielt Genexpression…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC), H-JZ. TMBW ist ein Empfänger von Australien Postgraduate Award der australischen Regierung und der Ann Henderson Top-up Stipendium von australischen Rotary Gesundheit auf Partner mit Rotary Templestowe und Dine für eine Heilung.
Materials
| DMEM | ThermoFisher | 1881024 | Warm in 37 °C waterbath before use |
| Foetal Bovine Serum | Scientifix Life | FBS500-S | Heat inactivated before use |
| Recombinant Human TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21 | Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL |
| Hoechst-33258 | Tocris Bioscience | 5117 | Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL |
| Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | 197897 | Dilute 5x in PBS before use |
| Luminometer | Promega | 9100-002 | |
| Phase contrast fluorescence microscopy | OLYMPUS | IX50 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810 R | |
| VivoGl Luciferin | Promega | P1041 | |
| IVIS Lumina III In Vivo Imaging System | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | ThermoFisher | 15400-054 | Diltue to 0.05% (1x) in PBS |
| Cell Culture Lysis 5x Reagent | Promega | E153A | Dilute to 1x in DDW |
| 10% Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| HEK 293A | ThermoFisher | R70507 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | CRM-HTB-26 | |
| PRKDC-SCID | Animal Resources Centre | SCIDF6 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Isoflurane | Zoetis | 26675-46-7 | |
| Ethanol | Chem-supply | EA043-10L-P | |
| Refresh Night Time | Allergan | 1750D | Lubricating Eye Ointment |
| Solution | Composition | ||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M) | ||
| FBS-DMEM | 5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin |
Referências
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