Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Summary

Des études ex vivo îlots pancréatiques sont importants pour la recherche sur le diabète. Les techniques existantes pour étudier des îlots cultivés dans leur architecture 3D natif sont chronophages, inefficace et rarement utilisés. Cet ouvrage décrit une méthode nouvelle, simple et efficace pour générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots cultivés ensemble.

Abstract

Expériences utilisant des îlots pancréatiques isolés sont importantes pour la recherche sur le diabète, mais les îlots sont coûteux et d’abondance limitée. Îlots contiennent une population de cellules mixtes dans une architecture structurée ayant une incidence sur la fonction et îlots humains varient largement dans la composition de type cellulaire. Cours méthodes fréquemment utilisées pour étudier les îlots cultivés comprennent des études moléculaires effectuées des îlots entiers, mettre types de cellules d’îlot disparates ensemble, ou microscopie ou études moléculaires sur des cellules des îlots dispersés, perturbant l’architecture de l’îlot. Pour les études in vivo îlot, coupes de pancréas de paraffine est une technique puissante pour évaluer les résultats spécifiques des cellules dans l’environnement natif du pancréas. Étude après culture des îlots en paraffine sectionnant offrirait plusieurs avantages : détection des résultats multiples sur le mêmes îlots (peut-être même les îlots exact-même, à l’aide de coupes sériées), mesures de cellule-type spécifique et maintien native Îlot cellule-cellule et cellule-substrat interactions tant pendant l’exposition expérimentale et pour l’analyse. Cependant, les techniques existantes pour l’enrobage isolement îlots après culture sont inefficaces, votre temps, enclins à la perte de matière et produisent généralement des sections avec des nombres insuffisants îlot utile pour quantifier les résultats. Installations de préparation de pathologie clinique laboratoire cellule bloc sont inaccessibles et peu pratique pour les laboratoires de recherche fondamentale. Nous avons développé une méthode de paillasse améliorée et simplifiée qui génère des sections avec rendement robuste et distribution des îlots. Îlots fixes sont remises en suspension en gel d’agarose histologique chaud et distribués dans un disque plat sur une lame de verre standard, tels que les îlots sont distribuées dans un plan. Après déshydratation standard et d’incorporation, plusieurs (10 +) 4-5 µm sections peuvent être coupées à partir du même bloc de l’îlot. En utilisant cette méthode, les analyses histologiques et immunofluorescence sont possibles sur les souris, rat et îlots humains. Il s’agit d’une approche efficace, peu coûteuse, gain de temps pour évaluer le type-spécifiques des cellules intactes-architecture issues des îlots cultivés.

Introduction

Pancréas, îlots de Langerhans, la seule source d’insuline, en circulation sont un tissu de critique pour les chercheurs étudient le diabète sucré. De tout organisme donné, les îlots ont taille variable, la fréquence de type cellulaire et architecture^1,2,3. La stratégie conventionnelle à l’étude in vivo de structure et la composition de la cellule endocrine des îlots pancréatiques est en sectionnant le pancréas tissus^4,5. Puisque les îlots composent seulement une petite fraction du total contenu cellulaire pancréatique, études moléculaires sont effectuées sur les îlots isolés. Ex vivo îlot cultures expérimentales test réponse aux nutriments, modulation de gène (transfection, transduction), ou des traitements expérimentaux donnent un aperçu important des mécanismes modulant la fonction, la prolifération et la survie des cellules endocrines ^{5 , 6}.

Ex vivo des expériences îlot sont souvent analysées à l’aide des études moléculaires des îlots entiers ou des études histologiques ou moléculaires dispersé des cellules des îlots cultivés en monocouche^5,6. Analyse moléculaire des îlots entiers introduit la mise en garde sérieuse de mélanger types de cellules, qui peut produire des résultats faussement négatifs ou des faux positifs lorsque extrapolés à n’importe quel type de cellule individuelle. Dispersion de cellule sur lamelles couvre-objet pour la microscopie après culture permet la mesure des résultats de la cellule-type spécifique, mais perturbe l’architecture de l’îlot, qui peut-être altérer la réponse à l’intervention et s’oppose à une identification des résultats axés sur l’architecture. En outre, en général seulement un seul résultat peut être mesuré ; par exemple, pour mesurer la prolifération des cellules bêta et la mort des cellules bêta dans les mêmes conditions, deux expériences distinctes doivent être effectuées. Ces approches sont aussi aveugles à la variabilité inter-îlot, un domaine d’intérêt croissant dans le domaine. Tri des cellules des îlots par cytométrie de flux pour cellule-type spécifique études moléculaires, ou unicellulaires RNA sont élégantes mais cher, beaucoup de temps, limité par l’abondance de tissus, architecture-éradication et pas bien adapté aux analyses de routine cell culture ^{5 , 7}. imagerie confocale des îlots entiers immunomarquage fournit des données intactes-architecture de qualité, mais il est beaucoup de travail, et les données obtenues à partir de chaque échantillon sont limitées aux résultats identifiables dans un seul immunostaining⁸.

La capacité de générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots entiers après culture permettrait de résoudre nombre de ces préoccupations. Tissu de l’îlot de desserte à coût élevé, faible abondance de modèles génétiques uniques ou de donneurs d’organes humains, ou îlots statut post in vivo ou in vitro la manipulation expérimentale, sont précieux. Obtention de plusieurs sections de paraffine d’îlots mêmes permettrait plusieurs analyses de cellule-type spécifique, intact-architecture de la même expérience.

Les techniques existantes pour générer des pastilles de l’îlot pour le sectionnement sont imparfaits. Histologie-optimisé agarose est un gel aqueux bas point de fusion qui est employé couramment dans le traitement des spécimens cytologiques et histologiques, y compris des échantillons de tissus petit ou fragmentée qui sont difficiles à processus⁹. Un îlot enraciner approche consiste à suspendre les îlots dans l’agarose dans un tube de microcentrifuge, centrifuger pour le matériel de granule, récupérer la fiche de gélose, puis traiter et intégrer pour le sectionnement^10,11. Extraire l’échantillon solidifiée par le bas du tube est longue et difficile, conduisant à une fragmentation occasionnelle de l’échantillon et risque de blessures corporelles. Les îlots sont concentrés dans la pointe de la fiche, conduisant à une répartition inadéquate îlot aux points obtenues par cette méthode. Le fond rond du bouchon complique incorporation telle qu’une région pauvre en îlot peut être présentée à la section. Dans l’ensemble, cette méthode conduit à faible rendement et de la distribution d’îlot contagieuse dans les sections qui en résulte.

Cette nouvelle méthode est une approche simplifiée et améliorée pour la préparation des sections de l’îlot. Îlots sont concentrées dans un petit volume et ensuite placées sur la surface lisse d’une lame de microscope pour former un petit disque, avec les îlots dans un seul plan. Le disque Histogel-îlot est traité par la suite pour incorporation dans un protocole de l’infiltration de xylène et déshydratation raccourcie de paraffine. L’approche précédente, qui concentre les îlots dans le fond d’un tube à centrifuger, est également réalisée en guise de comparaison. Cette nouvelle technique améliore le rendement des îlots par section, la répartition des îlots dans chaque section et prend moins de temps pour transférer les blocs de l’îlot à cassettes. Cette technique est utile pour les biologistes de l’îlot ou autres scientifiques qui étudient les petits morceaux de tissu souhaitent maximiser productif utilisent un tissu de faible abondance en mesurant les résultats multiples sur un seul échantillon dans son architecture native de tissu.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité de l’utilisation et de UMass Medical School institutionnels Animal Care. Études des îlots pancréatiques humains ont été déterminées par la Commission de révision institutionnelle UMass à ne sont ne pas admissibles à l’examen de la CISR ou exemption parce qu’ils n’impliquent pas l’utilisation de sujets humains. 1. culture et l’isolement de l’îlot Isoler les îlots et séparer de…

Representative Results

Un schéma illustré des étapes pour préparer la Couronne gel est illustré à la Figure 1. Ce résultats de méthode gel disque en sections de paraffine qui contiennent un nombre suffisant d’îlots répartis dans un seul plan pour permettre une quantification significative des résultats. La figure 2 montre des images de faible grossissement des sections qui en résulte pour illustrer le nombre d’îlots capturé par sectio…

Discussion

Cette méthode d’encastrement mis à jour le gel-disque-base fournit un simple, peu coûteux et un moyen efficace pour générer un rendement élevé des îlots par section. Construire la Couronne gel sur une surface de verre plat facilite l’épandage îlots dans une distribution uniforme sur une zone bien définie. Répandre les îlots dans un disque plat offre l’avantage de placer plusieurs îlots dans le plan de section, optimiser le rendement et permettant des îlots moins à utiliser. L’épaisseur du disque …

Materials

1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001