Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina
Summary
Ex vivo dell’isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.
Abstract
Gli esperimenti usando isolotti pancreatici isolati sono importanti per la ricerca sul diabete, ma gli isolotti sono costosi e di abbondanza limitata. Isolotti contengono una popolazione di cellule miste in un’architettura strutturata che gli impatti funzione e isolotti umani sono ampiamente variabile nella composizione di tipo cellulare. Attuali metodi utilizzati di frequente per studiare isolotti coltivati includono studi molecolari su isolotti interi, tipi di cellule dell’isolotto disparati lumping insieme, o microscopia o studi molecolari su cellule disperse dell’isolotto, interrompendo l’architettura dell’isolotto. Per in vivo gli studi dell’isolotto, paraffina pancreas sezionamento è una potente tecnica per valutare i risultati di cellula-specifico nell’ambiente del pancreas nativo. Studiando la post-cultura isolotti dalla divisione di paraffina sarebbe offrono diversi vantaggi: rilevamento di risultati multipli sulla stessi isolotti (potenzialmente anche lo stessa esatta isolotti, utilizzando sezioni di serie), le misure di cellula-tipo-specifico e mantenimento nativo isolotto-cellula e cellula-substrato interazioni sia durante l’esposizione sperimentale che per l’analisi. Tuttavia, le tecniche esistenti per l’incorporamento isolato isolotti post-cultura sono inefficienti, che richiede tempo, soggetta a perdita di materiale e generalmente producono sezioni con numeri di isolotto inadeguata per essere utili per quantificare i risultati. Impianti di preparazione delle cella blocco del laboratorio di patologia clinica sono inaccessibili e poco pratico per i laboratori di ricerca di base. Abbiamo sviluppato un metodo di banco migliorato, semplificato che genera sezioni con resa robusta e distribuzione degli isolotti. Fissi isolotti sono risospese in gel di agarosio istologico caldo e pipettati in un disco piatto su un vetrino standard, tale che gli isolotti sono distribuiti in un aereo. Dopo disidratazione standard e incorporamento, più (10 +) 4-5 µm sezioni possono essere tagliati dallo stesso blocco dell’isolotto. Utilizzando questo metodo, analisi istologiche ed immunofluorescenti possono essere eseguite sul topo, ratto e isolotti umani. Si tratta di un approccio efficace, poco costoso, risparmio di tempo per valutare i risultati specifici del tipo di cellula, architettura intatta da isolotti coltivati.
Introduction
Isole di Langerhans, la sola fonte di insulina, di circolazione sono un tessuto critico per gli investigatori studiando il diabete mellito. Da qualsiasi dato organismo, isolotti hanno dimensione variabile, frequenza di tipo cellulare e architettura1,2,3. La strategia convenzionale di studiare in vivo struttura e composizione endocrina delle cellule degli isolotti pancreatici è sezionando pancreas tessuto4,5. Poiché gli isolotti comprendono solo una piccola frazione del totale contenuto cellulare pancreatica, gli studi molecolari sono svolti su isolotti isolati. Ex vivo dell’isolotto cultura esperimenti di verifica risposta a nutrienti, modulazione genica (trasfezione, trasduzione), o trattamenti sperimentali forniscono comprensione importante nei meccanismi che modulano la funzione, la proliferazione e sopravvivenza delle cellule endocrine 5 , 6.
Ex vivo esperimenti isolotto spesso sono analizzati utilizzando gli studi molecolari degli isolotti interi o studi istologici o molecolari delle cellule dell’isolotto disperso coltivate in monostrato5,6. L’analisi molecolare degli isolotti interi introduce l’avvertimento serio di mescolanti tipi di cellule, che possono produrre risultati falsi-negativi o falsi positivi quando estrapolati per qualsiasi tipo di cellula individuale. Dispersione delle cellule sul coprioggetto per post-cultura microscopia permette la misura di esito di cellula-tipo-specifico, ma sconvolge architettura dell’isolotto, che può alterare la risposta ad intervento e preclude l’identificazione dei risultati legati al architettura. Inoltre, generalmente solo un singolo risultato può essere misurato; ad esempio, per misurare la proliferazione delle cellule beta e la morte delle cellule beta nelle stesse condizioni, due esperimenti separati devono essere eseguite. Questi approcci sono anche ciechi alla variabilità inter-isolotto, un’area di crescente interesse nel campo. Le cellule dell’isolotto ordinamento tramite flusso cytometry per studi molecolari specifici del tipo di cellula o di cella singola RNA studi sono eleganti ma costoso, richiede tempo, limitato da abbondanza di tessuto, eradicare l’architettura e non ben si adatta ad analisi di routine delle cellule cultura 5 , 7. formazione immagine confocal di intero-monta immunostained isolotti fornisce dati intatti-architettura di alta qualità, ma è alta intensità di manodopera, e i dati ottenuti da ciascun campione sono limitati ai risultati identificabili in un singolo immunostaining8.
La capacità di generare sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti interi post-cultura consentirebbe di affrontare molte di queste preoccupazioni. Tessuto dell’isolotto ad alto costo, basso-abbondanza da modelli genetici unici o da donatori di organi umani, o isolotti stato post in vivo o in vitro manipolazione sperimentale, sono preziosi. Come ottenere di più sezioni di paraffina dalle isolette stesse consentirebbe analisi multiple di cellula-tipo-specifico, architettura intatta dallo stesso esperimento.
Le tecniche esistenti per generare pellet dell’isolotto per il sezionamento sono imperfette. Istologia-ottimizzato dell’agarosi sono un gel acquoso basso punto di fusione che è ampiamente usato nell’elaborazione di campioni istologici e citologici inclusi campioni di tessuto piccolo o frammentati che sono difficili da processo9. Un isolotto l’incorporamento di approccio è quello di sospendere gli isolotti in agarosio in un tubo del microcentrifuge, centrifugare a pellet il materiale, recuperare la spina di agar, poi elaborare e incorporare per il sezionamento10,11. Estrarre il campione solidificato dalla parte inferiore del tubo è che richiede tempo e difficile, portando a occasionali frammentazione del campione e rischio di lesioni personali. Gli isolotti sono concentrati nella punta della spina, che conduce alla distribuzione inadeguata dell’isolotto in sezioni ottenute da questo metodo. Il fondo rotondo della spina complica l’incorporamento tale che una regione dell’isolotto-poveri può essere presentata per il sezionamento. Nel complesso, questo metodo porta a bassa resa e distribuzione ragruppata isolotto nelle sezioni risultante.
Questo nuovo metodo è un approccio semplificato e migliorato per la preparazione di sezioni dell’isolotto. Gli isolotti sono concentrati in un piccolo volume e poi messo sulla superficie liscia di un vetrino da microscopio per formare un piccolo disco, con gli isolotti in un unico piano. Il disco Histogel-isolotto è successivamente trattato per inclusione in un protocollo di infiltrazione di xilene e ridotta disidratazione a paraffina. L’approccio precedente, che si concentra sugli isolotti nella parte inferiore di un tubo di microfuge, avviene anche come termine di paragone. Questa nuova tecnica migliora il rendimento degli isolotti per ogni sezione, la distribuzione degli isolotti in ogni sezione e richiede meno tempo per trasferire i blocchi dell’isolotto a cassette. Questa tecnica è utile per i biologi dell’isolotto o altri gli scienziati che studiano i piccoli pezzi di tessuto che desiderano massimizzare produttivo utilizzano di un tessuto basso-abbondanza misurando i risultati multipli su un singolo campione nella sua architettura di tessuto nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo di incorporamento gel a base di disco modificato fornisce un semplice, poco costoso e un modo efficace per generare un rendimento elevato degli isolotti per ogni sezione. Costruire il disco gel su una superficie di vetro piano facilita spalmare isolotti in una distribuzione uniforme su un’area ben definita. Diffondere gli isolotti in un disco piatto offre il vantaggio di immissione molti isolotti nel piano della sezione, ottimizzando il rendimento e permettendo minori isolotti essere utilizzato. Lo spessore…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine il gruppo di biologia delle cellule Beta all’UMass diabete centro di eccellenza per le discussioni e consigli utili. Isolotti pancreatici umani sono stati forniti dal NIDDK-finanziato integrato isolotto distribuzione programma (IIDP) alla città della speranza. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) e dall’associazione americana del diabete concedere n. 1-15-BS-003 (LCA) in collaborazione con l’ordine dell’amaranto.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
Referências
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