Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Summary

Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.

Abstract

Experimentos con islotes pancreáticos aislados son importantes para la investigación de la diabetes, pero islotes son costosos y de limitada abundancia. Islotes contienen una población de mezclado de la célula en una arquitectura estructurada que afecta a la función, e islotes humanos son ampliamente variables en la composición del tipo de célula. Métodos actuales utilizados para el estudio de islotes cultivados incluyen estudios moleculares realizados en islotes enteros, junten tipos de células de islote dispares juntos, o microscopía o estudios moleculares en células de los islotes dispersos, alterar la arquitectura de la isla. En vivo estudios de islote, secciones parafina-encajadas del páncreas es una técnica poderosa para evaluar los resultados de células específicas en el entorno nativo de páncreas. Estudiando la post-cultura islotes dividiendo el parafina ofrece varias ventajas: detección de múltiples resultados de mismo islotes (potencialmente incluso el mismo exacto islotes, mediante secciones seriadas), las medidas específicas del tipo celular y nativos manteniendo islote célula-célula y célula-sustrato interacciones durante la exposición experimental y de análisis. Sin embargo, técnicas existentes para incrustar aislaron islotes de cultura post son ineficientes, lentos, propensos a la pérdida de material y generalmente producen secciones con números islote inadecuada para ser útil para la cuantificación de los resultados. Patología clínica celular bloque preparación laboratorios son inaccesibles y poco práctico para los laboratorios de investigación básica. Hemos desarrollado un método de banco mejorado y simplificado que genera secciones con sólido rendimiento y distribución de los islotes. Islotes fijos son suspendidas en gel de agarosa histológica caliente y pipeta en un disco plano en un portaobjetos de vidrio estándar, tal que las islas se distribuyen en un plano. Después de deshidratación estándar e incrustación, (10 +) 4-5 μm las secciones múltiples se pueden cortar de la misma cuadra del islote. Usando este método, pueden realizarse análisis histológicos e inmunofluorescencia en ratón, rata e islotes humanos. Este es un enfoque eficaz, barato, ahorro de tiempo para evaluar los resultados específicos de tipo celular, intacta arquitectura de islotes cultivados.

Introduction

Páncreas islotes de Langerhans, la única fuente de circulación de insulina, son un tejido crítico para los investigadores de diabetes mellitus. De cualquier organismo dado, islotes tienen tamaño variable, la frecuencia de célula tipo y arquitectura^1,2,3. La estrategia convencional para estudiar en vivo la estructura y composición de células endocrinas de los islotes pancreáticos es dividiendo el páncreas tejido^4,5. Desde islotes constituyen sólo una pequeña fracción del contenido celular pancreática total, se realizan estudios moleculares en islotes aislados. Ex vivo islote cultura experimentos pruebas de respuesta a nutrientes, modulación del gene (transfección, transducción de señales), o tratamientos experimentales proporcionan la penetración importante en mecanismos de modulación de la función, la proliferación y supervivencia de la célula endocrina ^{5 , 6}.

A menudo los experimentos ex vivo del islote se analizan mediante estudios moleculares de islotes enteros o estudios histológicos o moleculares de células de los islotes dispersos en monocapa^5,6. Análisis molecular de islotes todo presenta la seria advertencia de mezclantes tipos de células, que pueden producir resultados falsos negativos o falsos positivos cuando se extrapolan a cualquier tipo de célula individual. Dispersión de células sobre cubreobjetos para microscopia de la cultura permite la medida de resultado específicas de tipo celular, pero altera la arquitectura del islote, que puede alterar la respuesta a la intervención y excluye la identificación de los resultados relacionados con la arquitectura. Además, generalmente solamente un resultado solo puede ser medido; por ejemplo, para medir la proliferación de la célula beta y la muerte de la célula beta en las mismas condiciones, dos experimentos separados deban realizarse. Estos enfoques también son ciegos a la variabilidad inter-islote, un área de creciente interés en el campo. Clasificación las células del islote por citometría de flujo para estudios moleculares de la célula-tipo-específico, o estudios de RNA unicelulares son elegantes pero costoso, desperdiciador de tiempo, limitada por la abundancia de tejido, erradicación de arquitectura y no muy adecuado para análisis de rutina de la célula cultura ^{5 , 7}. proyección de imagen confocal de islotes de Monte conjunto immunostained proporciona datos intacta arquitectura de alta calidad, pero es mano de obra, y datos obtenidos de cada muestra se limita a los resultados identificables en immunostaining solo⁸.

La capacidad para generar secciones de parafina de alta calidad de islotes todas cultura post abordará muchas de estas preocupaciones. Tejido del islote de alto costo, baja abundancia de modelos genéticos únicos o de los donantes de órganos humanos, o islotes estado post in vivo o in vitro manipulación experimental, son preciosos. Obtención de múltiples secciones de la parafina de los islotes mismo permitiría múltiples análisis específicos de tipo celular, intacta arquitectura desde el mismo experimento.

Técnicas existentes para generar pellets de islote para seccionamiento son imperfectas. Histología-optimizado de la agarosa es un gel acuoso bajo punto de fusión que es ampliamente utilizado en el procesamiento de muestras histológicas y citológicas, incluyendo muestras de tejidos pequeños o fragmentados que son difíciles de proceso⁹. Un islote inclusión enfoque es suspender los islotes en agarosa en un tubo de microcentrífuga, centrífuga para el material de la pelotilla, recuperar el tapón de agar, luego procesar y embed para seccionamiento^10,11. Extracción de la muestra solidificada de la parte inferior del tubo es lento y difícil, lleva a la fragmentación ocasional de la muestra y el riesgo de lesiones personales. Los islotes están concentrados en la punta de la clavija, islote inadecuada distribución en secciones obtenidas por este método. El fondo redondo del enchufe complica incorporar tales que puede presentar una región pobre en islote de seccionamiento. En general, este método conduce a bajo rendimiento y distribución islote agrupada en las secciones resultantes.

Este nuevo método es un enfoque simplificado y mejorado para la preparación de las secciones del islote. Islotes son concentrados en un pequeño volumen y luego se coloca en la superficie lisa de un portaobjetos de microscopio para formar un pequeño disco, con los islotes en un solo plano. El disco de Histogel-islote es posteriormente procesado para parafina incrustar en una deshidratación acortada y Protocolo de infiltración de xileno. El anterior planteamiento, que concentra los islotes en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga, también se lleva a cabo como una comparación. Esta nueva técnica mejora el rendimiento de islotes por sección, la distribución de los islotes en cada sección y toma menos tiempo para transferir los bloques islote casetes. Esta técnica es útil para los biólogos de islote u otros científicos estudiando pequeñas porciones de tejido que deseen maximizar productividad usan de un tejido de baja abundancia mediante la medición de los resultados múltiples en una sola muestra en su arquitectura de tejido propio.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por la Comisión de uso y de UMass Medical School institucional Animal Care. Estudios del islote humano fueron determinados por la Junta de revisión institucional de UMass para no calificar para la revisión IRB o exención porque no implican el uso de sujetos humanos. 1. islote aislamiento y cultura Islotes de aislar y separar contaminantes tejido exocrino y ductal mediante el método de su elección.Nota: Este m…

Representative Results

Figura 1muestra un esquema ilustrado de los pasos para preparar el disco de gel. Este gel disco método los resultados en las secciones de la parafina que contienen un número suficiente de islotes distribuidos en un solo plano para permitir la cuantificación significativa de los resultados. Figura 2 muestra las imágenes de baja magnificación de las secciones resultantes para ilustrar el número de islotes capturados por secci…

Discussion

Este método de empotrar modificado basado en el disco de gel proporciona un simple, barato y la forma eficiente para generar un alto rendimiento de islotes por sección. Construyendo el disco gel sobre una superficie de vidrio plano facilita islotes que se separa en una distribución uniforme sobre un área bien definida. Difusión de los islotes en un disco plano ofrece la ventaja de colocar muchos islotes en el plano de la sección, optimizando el rendimiento y permitiendo menos islotes ser utilizado. El grueso del di…

Materials

1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001