Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Summary

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Abstract

Experimentos utilizando ilhotas pancreáticas isoladas são importantes para a pesquisa do diabetes, mas ilhéus são caros e de abundância limitada. Ilhéus contêm uma população mista de célula em uma arquitetura estruturada que afeta a função e ilhotas humanas são amplamente variável na composição do tipo de célula. Atuais métodos usados com frequência para estudar ilhotas cultivadas incluem estudos moleculares, executados em toda Ilhéus, amontoando ilhéu diferentes tipos de células juntos, ou microscopia ou estudos moleculares em células das ilhotas dispersas, rompendo a arquitetura do Ilhéu. Estudos em vivo ilhéu, seccionamento de pâncreas de parafina é uma técnica poderosa para avaliar resultados de células específicas no ambiente nativo do pâncreas. Estudando a pós-cultura ilhotas secionando parafina que oferecem várias vantagens: deteção de vários resultados na mesmas ilhotas (potencialmente até as exato a mesma ilhotas, usando seções seriais), medições específicas do tipo de célula e mantendo nativo Ilhéu célula-célula e célula-substrato interações durante a exposição experimental e para análise. No entanto, as técnicas existentes para a incorporação de isolaram ilhotas pós-cultura são ineficientes, demorado, propenso a perda de material e geralmente produzem seções com números ilhéu inadequada para ser útil para quantificar os resultados. Instalações da preparação do bloco de célula laboratoriais de patologia clínica são inacessíveis e impraticável para laboratórios de pesquisa básica. Nós desenvolvemos um método de bancada melhorado e simplificado que gera seções com rendimento robusto e distribuição de ilhotas. Fixo de Ilhéus é resuspended em gel de agarose histológica quente e pipetado em um disco plano em uma corrediça de vidro padrão, tal que os ilhéus são distribuídos em um avião. Após desidratação padrão e incorporando, seções múltiplas (10 +) 4-5 µm podem ser cortadas do mesmo bloco ilhéu. Usando esse método, análises histológicas e imunofluorescência podem ser executadas em rato, rato e ilhotas humanas. Esta é uma abordagem eficaz, barata, economia de tempo para avaliar resultados de célula tipo-específicas, intacto-arquitetura de ilhotas culturas.

Introduction

Pancreáticas ilhotas de Langerhans, a única fonte de insulina, em circulação são um tecido crítico para os investigadores a estudar diabetes mellitus. De um determinado organismo, Ilhéus têm tamanho variável, frequência do tipo de célula e arquitetura^1,2,3. A estratégia convencional para estudar na vivo estrutura e composição de células endócrinas das ilhotas pancreáticas é secionando pâncreas tecido^4,5. Desde Ilhéus compõem apenas uma pequena fração do conteúdo total de celular do pâncreas, estudos moleculares são executados em ilhotas isoladas. Ex vivo ilhéu cultura experiências testando a resposta aos nutrientes, modulação de gene (transfeccao, transdução), ou tratamentos experimentais fornecem importantes insights sobre mecanismos de modulação da função, proliferação e sobrevivência de células endócrinas ^{5 , 6}.

Ex vivo experimentos ilhéu frequentemente são analisados usando estudos moleculares de ilhotas inteira ou estudos histológicos ou moleculares das ilhotas dispersas células cultivadas em monocamada^5,6. Análise molecular de ilhotas toda introduz a séria advertência entremear tipos de células, que podem produzir resultados falso-negativos ou falso-positivos quando extrapolados para qualquer tipo de célula individual. Dispersão de célula para lamínulas para microscopia de pós-cultura permite a medição de resultado de célula-tipo específico, mas interrompe a arquitetura do Ilhéu, que pode alterar a resposta à intervenção e impede a identificação dos resultados relacionados com arquitetura. Além disso, geralmente apenas um único resultado pode ser medido; por exemplo, para medir a proliferação de células beta e morte de células beta, nas mesmas condições, dois experimentos separados precisam ser executadas. Essas abordagens também são cegas à variabilidade inter ilhéu, uma área de interesse crescente no campo. Classificação células das ilhotas por citometria de fluxo para estudos moleculares de célula tipo-específicos, ou estudos de RNA de célula única são elegantes, mas caro, demorado, limitado pela abundância de tecido, erradicar a arquitetura e não é bem adequado para análises de cultura celular de rotina ^{5 , 7}. imagem latente confocal de ilhotas immunostained toda a montagem fornece alta qualidade intacta-arquitetura dados, mas é trabalhoso, e dados obtidos de cada amostra são limitados aos resultados identificáveis em um único immunostaining⁸.

A capacidade de gerar seções de alta qualidade da parafina de ilhotas toda pós-cultura abordaria muitas dessas preocupações. Tecido de ilhéu de alto custo e baixa-abundância de modelos genéticos únicos ou de doadores de órgãos humanos, ou ilhotas status post vivo em ou em vitro experimental manipulação, são preciosos. Obtenção de várias seções de parafina de Ilhéus mesmos permitiria múltiplas análises específicas do tipo de célula, arquitetura intacta no mesmo experimento.

Técnicas existentes para gerar pelotas ilhéu para secionar são imperfeitas. Histologia-otimizado agarose é um gel aquoso baixo ponto de fusão que é amplamente utilizado no processamento de amostras histológicas e citológicas, incluindo amostras de tecido pequeno ou fragmentados que são difíceis de processo⁹. Um ilhéu, incorporando a abordagem é para suspender as ilhotas em agarose em um tubo de microcentrifugadora, centrifugar para o material de Pelotas, recuperar a ficha de agar, então processar e incorporar para secionar^10,11. Extrair a amostra solidificada da parte inferior do tubo é demorado e difícil, levando a fragmentação ocasional da amostra e risco de danos pessoais. Os ilhéus concentram-se na ponta do plugue, levando a distribuição inadequada Ilhéu em seções obtidas por este método. O fundo redondo do plugue complica incorporando tais que uma região pobre em ilhéu possam ser apresentada para corte. Em geral, esse método leva ao baixo rendimento e distribuição ilhéu agrupados nas seções resultantes.

Este novo método é uma abordagem simplificada e melhorada para a preparação das seções do Ilhéu. Ilhotas são concentradas em um pequeno volume e então colocadas sobre a superfície lisa de uma lâmina de microscópio para formar um disco pequeno, com as ilhotas em um avião. O disco Histogel-ilhéu é processado posteriormente para incorporação em uma desidratação encurtada e protocolo de infiltração de xileno de parafina. A abordagem anterior, que concentra os ilhéus na parte inferior de um tubo de microcentrífuga, também é realizada como uma comparação. Essa nova técnica melhora o rendimento de ilhotas por seção, a distribuição das ilhotas em cada seção e leva menos tempo para transferir os blocos do Ilhéu para fitas. Essa técnica é útil para os biólogos ilhéu ou outros cientistas estudando pequenos pedaços de tecido que desejam maximizar produtivo usam de um baixa abundância tecido medindo vários resultados em uma única amostra em sua arquitetura de tecido nativo.

Protocol

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo Comitê de uso e UMass Medical School institucional Animal Care. Estudos de ilhota humana foram determinados pelo Conselho de revisão institucional de UMass não qualificar para revisão do IRB ou isenção porque não envolvem o uso de cobaias humanas. 1. cultura e isolamento ilhéu Ilhotas de isolar e separar de contaminar o tecido exócrino e ductal, usando o método de sua escolha.Nota: Este método foi otimiza…

Representative Results

Uma esquema ilustrada das etapas para preparar o gel de disco é mostrada na Figura 1. Este gel de disco método resulta em cortes de parafina que contêm um número suficiente de ilhotas distribuídas em um único plano para permitir significativa quantificação dos resultados. A Figura 2 mostra imagens de baixo-ampliação das seções resultantes para ilustrar o número de ilhotas capturado por seção. Em geral, > 35 Ilhéus…

Discussion

Este método de encastre modificado baseados em gel-disco fornece um simples, barato e eficiente maneira de gerar um alto rendimento de ilhotas por seção. Construir o disco de gel sobre uma superfície plana de vidro facilita o espalhamento ilhotas em uma distribuição uniforme sobre uma área bem definida. Espalhar as ilhotas em um disco plano oferece a vantagem de colocar muitas ilhotas no plano da secção, otimizando o rendimento e permitindo menos ilhotas ser usado. A espessura do disco pode ser ajustada para ate…

Materials

1.5 mL Eppendorf tube	Norgen Bioteck Corp	P/N 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipette PR-2	ShopRanin	17008648
Low Binding Tip (1000 μL)	Genesee Scientific	24-430
Low Binding Tip (200 μL)	Genesee Scientific	24-412
Low Binding Tip (20 μL)	Genesee Scientific	24-404
Low Binding Tip (10 μL)	Genesee Scientific	24-401
10% Formalin solution	Sigma	HT501128
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Agarose blue beads- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Dulbecco's PBS	Life technologies	14190-144
Tissue processing cassette	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 tissue processor	Thermo-Shandon LLC
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, INC	2701
Xylene	Fisher Chemical	X5SK-4
Paraffin	McCormick Scientific	39503002
Microtome	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Insulin antibody	DAKO	A0564
Glucagon antibody	Sigma	G2654
Fluoroshield with DAPI	Sigma	F6057
Alex fluor 594 secondary antibodies	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 secondary antibodies	Life technologies	A11001