胰岛嵌段石蜡切片
Summary
体外胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。现有的技术, 研究培养的胰岛在其本机3维结构是耗时, 效率低下, 很少使用。这项工作描述了一种新的, 简单, 有效的方法, 以产生高质量的整个培养胰岛石蜡切片。
Abstract
使用孤立胰岛的实验对糖尿病研究很重要, 但胰岛价格昂贵, 丰度有限。胰岛在结构化结构中含有混合细胞种群, 影响功能, 而人胰岛在细胞类型组成中有广泛的变化。目前常用的研究培养胰岛的方法包括在整个胰岛上进行的分子研究, 将不同的胰岛细胞类型聚集在一起, 或对分散的胰岛细胞进行显微或分子研究, 扰乱胰岛结构。在体内胰岛研究中, 石蜡嵌入胰腺切片是一种强有力的技术来评估细胞特异的结果, 在当地的胰腺环境。通过石蜡切片研究后培养胰岛可以提供以下几个优点: 在同一个胰岛上检测多个结果 (可能甚至是同一个胰岛, 使用串行切片), 细胞类型特定测量, 以及维护本机胰岛细胞和细胞基质相互作用在实验性接触和分析。然而, 现有的嵌入孤立的胰岛后培养技术是低效的, 耗时的, 容易丢失的材料, 并通常产生的部分有不足的胰岛数字是有用的量化结果。临床病理实验室细胞块准备设施是不可访问的和不切实际的基础研究实验室。我们开发了一种改进的、简化的工作台顶部方法, 它产生的部分具有良好的产量和小岛分布。固定胰岛是悬浮在温暖的组织学琼脂糖凝胶和 pipetted 成一个平盘上的标准玻璃幻灯片, 这样的小岛分布在飞机上。在标准脱水和嵌入后, 可以从同一个胰岛块中切割出多个 (10 +) 4-5 µm 节。利用这种方法, 可以对小鼠、大老鼠和人胰岛进行组织学和免疫荧光分析。这是一个有效的, 廉价的, 节省时间的方法, 以评估细胞类型特定的, 完整的体系结构的结果, 从培养的胰岛。
Introduction
胰岛作为循环胰岛素的唯一来源, 是研究糖尿病的研究者的重要组织。从任何给定的有机体, 胰岛有可变大小, 细胞类型频率和建筑学1,2,3。常规的方法研究胰岛的体内结构和内分泌细胞组成是通过切片胰腺组织4,5。由于胰岛只占总胰细胞含量的一小部分, 因此在孤立的胰岛上进行分子研究。体外胰岛培养试验对养分、基因调制 (转染、转导) 或实验性治疗的反应, 为调节内分泌细胞生存、增殖和功能的机制提供重要的洞察力。5,6。
用全胰岛的分子研究或在单层5、6中生长的分散胰岛细胞的组织学或分子研究, 对体外胰岛实验进行分析。整个胰岛的分子分析引入了混合细胞类型的严重警示, 当外推到任何单个细胞类型时, 可能产生假阴性或假阳性结果。细胞分散到盖玻片后培养显微镜允许细胞类型特定的结果测量, 但扰乱胰岛体系结构, 这可能改变对干预的反应, 并排除与建筑有关的结果的识别。此外, 一般只有单一的结果可以测量;例如, 为了在相同的条件下测量β细胞增殖和β细胞死亡, 需要进行两个单独的实验。这些方法也忽视了胰岛间的变异性, 这是该领域越来越感兴趣的领域。用流式细胞仪对胰岛细胞进行细胞型特异分子研究, 或单细胞 RNA 研究是优雅但昂贵, 耗时, 受组织丰度限制, 建筑根除, 不太适合常规细胞培养分析5,7. 全芒 immunostained 岛的共焦成像提供高质量的完整的体系结构数据, 但劳动力密集型, 从每个样本获得的数据仅限于单染色8中可识别的结果。
在后培养的整个胰岛中产生高质量石蜡切片的能力将解决其中的许多问题。高成本, 低丰度的胰岛组织从独特的遗传模型或从人体器官捐献者, 或胰岛状态后的体内或体外实验操作, 是宝贵的。从同一个胰岛获得多个石蜡切片, 将允许来自同一实验的多细胞型特定的、完整的结构分析。
现有的用于切片的胰岛丸的技术是不完善的。组织学优化琼脂糖是一种水低熔点凝胶, 广泛用于处理组织学和细胞学标本, 包括小的或零碎的组织样本难以处理9。一种胰岛嵌入方法是在离心管中悬浮在琼脂糖中的胰岛, 离心机将材料颗粒, 回收琼脂插头, 然后加工和嵌入切片10,11。从管子底部提取凝固试样费时费力, 导致样品偶尔破碎, 人身伤害风险大。胰岛集中在插头的尖端, 导致不充分的胰岛分布在该方法获得的部分。插头的圆形底部使嵌入变得复杂, 这样就可以为切片提供一个小岛穷区域。总体上, 该方法在结果剖面上导致低产量和成群的胰岛分布。
这一新方法是一种简化和改进的方法, 为胰岛切片的准备。胰岛集中在一个小体积, 然后放在显微镜滑动的平滑表面形成一个小圆盘, 与胰岛在一个单一的平面。Histogel 胰岛盘随后被加工成石蜡嵌入在缩短脱水和二甲苯渗透协议。以前的方法, 集中的胰岛在离心管底部, 也进行了比较。这一新的技术提高了每节胰岛的产量, 每个部分的胰岛分布, 并花费较少的时间把胰岛块转移到磁带盒。这项技术是有用的胰岛生物学家或其他科学家研究的小块组织希望通过测量一个单一的样本在其本机组织结构的多个结果, 以最大限度地利用低丰度组织的生产。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种改进的基于凝胶盘的嵌入方法提供了一种简单、廉价、高效的方法来生成每节的胰岛高产。在平坦的玻璃表面上构建凝胶盘, 便于在一个明确的区域内均匀分布的小岛传播。将胰岛分布在平面盘中, 可以将许多胰岛放置在切片的平面上, 优化产量, 并允许使用较少的胰岛。圆盘厚度可以调整, 以满足调查人员的需要。由于可以获得多个部分, 同一胰岛的串行部分可以进行分析, 增加可在同一实验?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感激地感谢麻省糖尿病中心的β细胞生物学小组提供了有益的建议和讨论。人胰岛是由 NIDDK 资助的综合胰岛分布计划 (IIDP) 在希望的城市提供。这项工作由 NIH/NIDDK 资助: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) 和美国糖尿病协会赠款 #1-15 BS-003 (LCA) 与苋菜的顺序合作。
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
Referências
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
