Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte
Summary
Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.
Abstract
Experimente mit isolierten pankreatischen kleinen Inseln sind wichtig für Diabetes-Forschung, aber Inselchen sind teuer und der begrenzten Fülle. Inselchen enthalten einer gemischten Zellpopulation in einer strukturierten Architektur, die Funktion auswirkt, und menschliche Inselchen sind weit verbreitet in Zelle Typ Zusammensetzung variabel. Aktuelle häufig verwendete Methoden der kultivierte Inselchen zu studieren zählen Molekulare Studien auf ganze Inseln, begehen disparaten Inselchen Zelltypen zusammen, oder Mikroskopie oder Molekulare Studien über verteilte Inselzellen Inselchen Architektur zu stören. Für in Vivo Inselchen Studien ist Paraffin-eingebetteten Pankreas-Schnitt eine leistungsfähige Technik zellspezifische Ergebnisse in der nativen Pankreas-Umgebung zu bewerten. Post-Kultur Inselchen von Paraffin-Schnitt studieren würde bieten mehrere Vorteile: Erkennung von mehrere Ergebnisse für gleichen Inselchen (möglicherweise sogar die exakt gleichen Inselchen, mit Schnittserien), Handy-Typ-spezifische Messungen und Erhaltung Eingeborener kleine Insel Zell-Zell und Zelle-Substrat Interaktionen während experimentelle Exposition und zur Analyse. Jedoch isoliert vorhandene Techniken für die Einbettung von Inselchen Post-Kultur sind ineffizient, zeitaufwändig, anfällig für Verlust von Material und in der Regel produzieren Abschnitte mit unzureichenden Inselchen Zahlen bis zur Quantifizierung der Ergebnisse nützlich sein. Klinische Pathologie Zelle Block Vorbereitung Laboreinrichtungen sind unzugänglich und unpraktisch für grundlegende Forschungslabors. Wir haben eine verbesserte und vereinfachte Benchtop-Methode entwickelt, die Abschnitte mit stabile Erträge und Verteilung der Inselchen generiert. Feste Inselchen sind Nukleinsäuretablette in warmen histologischen Agarosegel und pipettieren in eine flache Scheibe auf einer standard-Glas-Folie, so dass die kleinen Inseln in einer Ebene verteilt sind. Nach standard Dehydrierung und einbetten können mehrere (10 +) 4-5 µm Abschnitte aus dem gleichen Inselchen Block geschnitten werden. Mit dieser Methode können auf Maus, Ratte und menschlichen Inselchen histologische und immunofluorescent Analysen durchgeführt werden. Dies ist eine effektive, kostengünstige, zeitsparende Ansatz zur Zelle-typspezifischen, intakt-Architektur Resultate von den kultivierten Inseln zu beurteilen.
Introduction
Pankreas Langerhans-Inseln, die einzige Quelle des zirkulierenden Insulin, sind eine kritische Gewebe für Ermittler Diabetes Mellitus zu studieren. Aus jedem gegebenen Organismus haben Inselchen variabler Größe, Zelle Art Frequenz und Architektur1,2,3. Die konventionelle Strategie in Vivo Struktur und Zusammensetzung der endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse Inselchen zu studieren ist durch Pankreas Gewebe4,5-Schnitt. Da Inseln nur einen kleinen Bruchteil des Pankreas zellulären Gesamtgehalt bestehen, sind Molekulare Studien auf isolierte Inseln durchgeführt. Ex-Vivo Inselchen Kultur Experimente testen ansprechen auf Nährstoffe, bieten gen Modulation (Transfektion, Transduktion) oder experimentelle Behandlungen wichtige Einblicke in Mechanismen moduliert endokrine Zelle überleben, Verbreitung und Funktion 5 , 6.
Ex-Vivo Inselchen Experimente sind oft mit molekularen Studien der ganzen Inseln oder histologische oder Molekulare Studien der dispergierten Inselzellen gewachsen in monomolekularen Film5,6analysiert. Molekulare Analyse der ganzen Inseln führt die schwere Einschränkung der mehrfache Zelltypen, die falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen auf jede einzelne Zelle Art hochgerechnet führen kann. Zelle Dispersion auf Deckgläsern für Post-Kultur-Mikroskopie ermöglicht Handy-Typ-spezifische Ergebnis Messung, aber stört Inselchen Architektur, die Reaktion auf Intervention verändern kann und Identifizierung von architekturbezogenen Ergebnisse ausschließt. Darüber hinaus kann in der Regel nur ein einziges Ergebnis gemessen werden; zum Beispiel um Beta-Zell-Proliferation und Beta-Zelltod unter den gleichen Bedingungen zu messen, müssen zwei separate Experimente durchgeführt werden. Diese Ansätze sind auch blind für Inter Inselchen Variabilität, eine Fläche von zunehmendes Interesse im Bereich. Sortier Inselzellen durch Durchflusszytometrie für Zelle-Typ-spezifischen molekularen Studien oder einzellige RNA Studien sind elegant, aber teuer, zeitaufwändig, begrenzt durch Gewebe Fülle, Beseitigung von Architektur und nicht gut geeignet, um routinemäßige Zelle Kulturanalysen 5 , 7. konfokale Bildgebung des gesamten-Mount Immunostained Inselchen bietet qualitativ hochwertige Daten intakt-Architektur, aber ist sehr arbeitsintensiv, und von jeder Probe gewonnene Daten beschränkt sich auf Ergebnisse in einem einzigen Immunostaining8erkennbar.
Die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des Post-Kultur ganze Inseln erzeugen würden viele dieser Bedenken ansprechen. Hohen Kosten, niedrig-Fülle Inselchen Gewebe von einzigartigen genetischen Modellen oder von menschlichen Organspendern oder Inselchen Status Post in Vivo oder in Vitro experimentelle Manipulation, sind kostbar. Erhalten mehrere Paraffin Abschnitte von den gleichen Inseln könnten mehrere Typ-zellspezifische intakt-Architektur Analysen aus dem gleichen Experiment.
Bestehende Techniken an Insel-Pellets für Schnitt erzeugen sind unvollkommen. Histologie-optimierte Agarose ist eine wässrige niedrigen Schmelzpunkt-Gel, die weit verbreitet ist in der Verarbeitung von histologischer und zytologischen Proben einschließlich fragmentierte oder kleine Gewebeproben, die schwer zu Prozess-9. Ein Inselchen Einbettung Ansatz ist, unterbrechen die Inselchen in Agarose in einem Microcentrifuge Schlauch, Zentrifugieren pellet-das Material, Abrufen des Agar-Steckers dann verarbeiten und embed für10,11-Schnitt. Extrahieren von verfestigten Probe von der Unterseite des Rohres ist zeitaufwändig und schwierig, was zu gelegentlichen Fragmentierung der Probe und Verletzungsgefahr. Die Inseln sind in der Spitze des Steckers, führt zu unzureichenden Inselchen Verteilung in Abschnitten, die von dieser Methode erhalten konzentriert. Der Runde Unterseite des Steckers erschwert einbetten, so dass eine kleine Insel-Armen Region für Schnitt dargestellt wird. Insgesamt führt diese Methode zu geringe Ausbeute und aufgehäuften Inselchen Verteilung in den sich daraus ergebenden Abschnitten.
Diese neue Methode ist eine vereinfachte und verbesserte Ansatz für die Vorbereitung der Insel Abschnitte. Inselchen sind konzentriert in einem kleinen Volumen und dann auf die glatte Oberfläche des einen Objektträger, eine kleine Scheibe mit den kleinen Inseln in einer Ebene zu bilden. Die Histogel-Insel-Scheibe ist für Paraffin, die Einbettung in eine verkürzte Dehydrierung und Xylol Infiltration Protokoll verarbeitet. Der bisherige Ansatz, der die Inseln in der Unterseite eines Microfuge Rohres konzentriert, wird auch als Vergleich durchgeführt. Diese neue Technik verbessert die Ausbeute an Inseln pro Abschnitt, die Aufteilung der Inseln in den einzelnen Abschnitten und nimmt weniger Zeit, die Insel-Blöcke auf Kassetten zu übertragen. Diese Technik eignet sich für kleine Insel Biologen oder andere Wissenschaftler studieren kleine Stücke des Gewebes, die Produktivität zu maximieren wollen verwenden eines Low-Fülle Gewebes durch die Messung mehrere Ergebnisse für ein einzelnes Sample in seiner nativen Gewebearchitektur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese modifizierte Gel-Disk-basierte Einbettungs-Methode bietet eine einfache, kostengünstige, und effiziente Möglichkeit, eine hohe Ausbeute an Inseln pro Abschnitt zu generieren. Bau der Gel-Disc auf einer flachen Glasoberfläche erleichtert Verbreitung Inselchen in eine gleichmäßige Verteilung über einen klar definierten Bereich. Verbreitung der Inseln in eine flache Scheibe bietet den Vorteil, setzen viele Inselchen in der Ebene des Abschnitts, Ertrag zu optimieren und damit weniger Inselchen verwendet werden. D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen dankbar an die Beta-Zellen-Biologie-Gruppe bei UMass Diabetes Center of Excellence für hilfreiche Ratschläge und Diskussionen. Menschlichen Pankreatische kleinen Inseln wurden durch die NIDDK finanzierte integrierte Islet Distribution Programm (IIDP) bei City of Hope zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von NIH/NIDDK finanziert: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) und von der American Diabetes Association gewähren #1-15-BS-003 (LCA) in Zusammenarbeit mit der Reihenfolge der Amaranth.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
Referências
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