Pазрешено внедрение для парафиновых срезах поджелудочной островок
Summary
Ex vivo поджелудочной островок исследования имеют большое значение для исследования мочеизнурения. Существующие методы для изучения культивировали островков в их родной 3-мерной архитектуры времени, неэффективны и редко используемых. Эта работа описывает новый, простой и эффективный метод для создания высококачественных парафиновых срезах вся культивировали островков.
Abstract
Эксперименты с использованием изолированных островков поджелудочной железы имеют важное значение для исследования мочеизнурения, но островки являются дорогостоящими и ограниченный изобилия. Островки содержат смешанные клетки населения в структурированную архитектуру, которая влияет на функции, и человеческих островках широко переменная в ячейке тип композиции. Текущий часто используемые методы для изучения культивировали островков относятся молекулярные исследования на весь островков, комков разрозненных островковых клеток типов вместе, или микроскопия или молекулярные исследования на рассредоточенных островковых клеток, нарушая островок архитектуры. В vivo исследований островок секционирование парафин врезанных поджелудочной железы – это мощный метод для оценки результатов конкретных клеток в родной среде поджелудочной железы. Изучая после культуры островков, парафин секционирование будет предлагать ряд преимуществ: обнаружение нескольких результатов на же островков (потенциально даже точное же островки, используя последовательный секции), клетки определенного типа измерений и сохранения родной островок-клеток и клеток субстрат взаимодействий во время экспериментального воздействия, а также для анализа. Однако существующие методы для встраивания изолированных островков после культуры являются неэффективным, трудоемким, склонны к потере материала и обычно производят секции с неадекватным островок чисел будут полезны для количественной оценки результатов. Клинической патологии клетки блока подготовки лаборатории являются недоступными и непрактичным для основных исследовательских лабораторий. Мы разработали улучшения, упрощенный стендовые метод, который генерирует секции с надежной урожайность и распределение островков. Фиксированной островков высокомобильна в теплых гистологические агарозном геле и накапаны в плоский диск на слайде стандартного стекла, таким образом, что островки распределены в плоскости. После стандартной обезвоживания и встраивание несколько (10 +) 4-5 мкм разделов можно вырезать из одного блока островок. С помощью этого метода, гистологические и immunofluorescent анализ может выполняться на мыши, крысы и человеческих островках. Это является эффективной, недорогой, экономящий время подход к оценке конкретного типа клеток, нетронутыми архитектура результатов от искусственного островков.
Introduction
Островки Лангерганса поджелудочной железы, единственным источником циркулирующего инсулина, являются критическим ткани для следователей, изучая сахарный диабет. Из любого данного организма островки имеют переменный размер, частота типа клеток и архитектуры1,2,3. Обычные стратегии для изучения в vivo структура и состав эндокринные клетки панкреатических островков, секционирование поджелудочной железы ткани4,5. Так как островки составляют лишь небольшую часть общего поджелудочной железы клеточного содержания, молекулярные исследования выполняются на изолированных островков. Ex vivo островок культуры эксперименты тестирование ответ на питательных веществ, Джин модуляции (трансфекции, трансдукция), или экспериментальное лечение обеспечивают важное понимание механизмы модуляции выживание эндокринные клетки, распространением и функции 5 , 6.
Ex vivo островок эксперименты часто анализируются с помощью молекулярных исследований всего островков или гистологических или молекулярных исследований дисперсных островковых клеток, выращиваемых в монослое5,6. Молекулярный анализ всего островков представляет серьезное предостережение перемешивающий типов клеток, которые может дать ложно отрицательные или ложно положительных результатов при экстраполяции на любой тип отдельных клеток. Дисперсия клеток на coverslips для микроскопии после культуры позволяет ячейки тип конкретных результатов измерения, но разрушает островок архитектуру, которая может изменить ответ на вмешательство и исключает возможность идентификации результатов, связанных с архитектурой. Кроме того обычно только один результат может быть измерена; например для измерения бета пролиферации и гибель бета клеток на тех же условиях, должны быть выполнены два отдельных экспериментов. Эти подходы также слепы к Интер островок изменчивости, площадь растущий интерес в области. Сортировки островковых клеток подачей cytometry для клеток тип-молекулярных исследований, или одно клеточной РНК исследований элегантной, но дорого, много времени, ограничивается ткани изобилия, архитектура искоренения и не хорошо подходит для обычной клетки культуры анализы 5 , 7. конфокальный изображений всего гора immunostained островков обеспечивает высокое качество нетронутыми архитектура данных, но является трудоемким, и данные, полученные от каждого образца ограничивается результаты в одном иммуноокрашивания8.
Возможность создания высококачественных парафиновых срезах после культуры всего островков рассмотрит многие из этих проблем. Ткани высокой стоимости, низкого изобилие островок от уникальной генетической модели или от доноров человеческих органов, или островков статус пост в естественных условиях или в пробирке экспериментально манипуляции, являются ценными. Получение нескольких парафиновых срезах же островков позволит несколько определенного типа клеток, нетронутыми архитектура анализа от же эксперимент.
Существующие методы для создания островок гранулы для разрезания несовершенны. Гистология оптимизированный агарозы является водный низкой температурой плавления гель, который широко используется в обработке гистологический и цитологический образцов, включая образцы малых или фрагментирован тканей, которые трудны для того чтобы процесс9. Один островок, внедрение подхода – приостановить островки в агарозы в пробки microcentrifuge, центрифуга гранул материал, извлечь штекер агар, а затем обрабатывать и внедрить для разрезания10,11. Извлечение затвердевших образца от нижней части трубки является трудоемким и сложным, приводит к фрагментации случайные выборки и риска травмирования. Островки сосредоточены в кончик вилку, приводит к неадекватным островок распределения в разделах, полученные из этого метода. Раунда нижней вилки осложняет внедрение таким образом, что островок плохой региона могут быть представлены для разрезания. В целом этот метод приводит к низкой урожайностью и распределения скомканным островок в результате секции.
Этот новый метод представляет собой упрощенный и Улучшенный подход для подготовки разделов островок. Островки сосредоточены в небольшом объеме и затем помещается на гладкой поверхности микроскопа сформировать небольшой диск, с островками в одной плоскости. Диск Histogel островок впоследствии обработаны для парафина, встраивание в укороченной обезвоживания и ксилол инфильтрации протокол. Предыдущий подход, который концентрируется островков в нижней части трубки отцентрифугировать, осуществляется также как сравнение. Эта новая методика повышает доходность островков в каждой секции, распределение островков в каждом разделе и занимает меньше времени для передачи блоков островок для кассет. Этот метод полезен для биологов островок или другие ученые, изучающие небольшие кусочки ткани, желающих максимально продуктивной использовать низкий обилие ткани путем измерения несколько результатов на один образец в своей родной ткани архитектуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот измененный гель диск на основе внедрения метод обеспечивает простой, недорогой и эффективным способом для создания высокодоходных островков в каждой секции. Строительство гель диск на поверхности плоского стекла облегчает распространение островков в равномерное распределение …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы с благодарностью признаем группе бета клеток биологии на UMass диабет центр повышения квалификации для полезные советы и дискуссий. Человека панкреатических островков были предоставлены, финансируемых NIDDK комплексной островок распределения программы (IIDP) в город надежды. Эта работа финансировалась NIDDK/НИЗ: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) и Американской ассоциации диабета Грант #1-15-BS-003 (LCA) в сотрудничестве с орденом Амарант.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
Referências
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
