Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit
Summary
Proteaz sıkıca düzenlenmiş temel biyolojik süreçlerin ve dysregulated proteaz aktivitesi sürücüler ilerleme kanser gibi karmaşık hastalıkların katılan enzimlerdir. Bu yöntemin hedef ana bilgisayar idrardan algılanabilir ve hastalık ayrımcılık bir bölünme sinyal üreterek proteaz aktivitesi in vivo ölçmek nanosensors oluşturmaktır.
Abstract
Proteaz peptid bağları hidroliz içinde uzmanlaşmak ve homeostasis ve allostasis dahil olmak üzere geniş biyolojik süreçleri kontrol çok fonksiyonlu enzimlerdir. Ayrıca, dysregulated proteaz aktivitesi Patogenez sürücüler ve kanser gibi hastalıkların işlevsel bir biyomarker olduğunu; Bu nedenle, proteaz aktivitesi in vivo algılama yeteneğini Biyomedikal teşhis için klinik olarak ilgili bilgi sağlayabilir. İdrarda ölçülebilir bir sinyal üreterek proteaz aktivitesi in vivo için yoklama nanosensors oluşturmak için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu proteaz nanosensors iki bileşenden oluşur: bir nanopartikül ve substrat. Hedef hastalığı sitelere dolaşım yarılanma ömrü ve substrat teslimat artırmak için nanopartikül işlevleri. Belgili tanımlık substrate belirli bir hedef proteaz veya proteaz grubu olmak üzere tasarlanmış bir kısa peptid (6-8 AA), sırasıdır. Belgili tanımlık substrate nanopartikül yüzeye Birleşik ve algılama için floresan bir işaret gibi bir gazeteci tarafından sonlandırıldı. Dysregulated proteaz peptid substrat ayırmak gibi muhabir proteaz aktivitesinin bir biyomarker olarak miktar için idrar içine süzülür. Burada bir nanosensor matriks metalloproteinaz 9 (MMP9), tümör ilerleme ve metastaz, bir fare modeli kolorektal kanseri tespiti ile ilişkili için inşaatı tarif.
Introduction
Proteaz peptid bağları hidroliz içinde uzmanlaşmak ve önemli homeostazı, allostasis ve hastalık1de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin kontrole sahip çok fonksiyonlu enzimlerdir. Bir değişmiş devlet proteaz aktivitesinin hastalıkları, kanser ve kardiyovasküler hastalık, proteaz çekici adaylar için geliştirme klinik biyolojik2,3içine yapım da dahil olmak üzere çeşitli korelasyon. Ayrıca, proteaz işlevsel olarak bağlantılı ayrı pathogeneses, hasta sonuçları ve hastalık4prognozunda faaliyettir. Geniş, biyosensörler çeşitli biyolojik olayları algılamak için geliştirilmiştir ve hastalıklar, kanser, nörodejeneratif hastalık ve Elektron transferi gibi işler5,6,7,8 , 9. daha ayrıntılı olarak, substrat tabanlı proteaz sensörler proteaz bir etkinlik tespit ve fluorogenic sondalar10 görüntüleme tanı için eklemek için geliştirilen edilmiş ve isotopically peptid yüzeylerde içinde vitro için etiketli Algılama işlemi, kütle spektrometresi11tarafından. Buna ek olarak, hangi bağlamak veya değiştirme hedef proteaz12substrat benzeri bölgeleri içeren etkinlik tabanlı probları geliştirilmiştir. Bu yöntemde, hedef proteaz geri dönüşümsüz aktif değiştirilir ve in vivo uygulamaları sınırlayan dokusunun hasat analiz gerektirir engellenir. Ancak, yönetmelik proteaz aktivitesinin ağır endojen inhibitörleri varlığı gibi diğer biyolojik etkinlikler kapsamında bağlı olduğundan proteaz aktivitesi in vivo, anlamda önemlidir.
Amaç bu eserin idrarda ölçülebilir bir sinyal üreterek proteaz aktivitesi vivo içinde algılamak etkinlik tabanlı nanosensors formülasyonu tarif etmektir. Bu platform bir noninvaziv tanı dysregulated proteaz aktivitesi işlevsel bir biyomarker kullanarak karmaşık hastalıklar kanser gibi ayrımcılık için kullanılır. Nanosensor platformumuz proteaz yüzeyler için Birleşik demir oksit nano tanecikleri (IONP) oluşur. Bu yüzeylerde proteaz substrat ayırmak bağlandığınızda serbest floresan bir muhabir tarafından sonlandırılır. Bu IONPs vivodolaşımını, hastalık sitelere yerelleştirilmesine ve yüzeylerde aktif hastalık ilişkili proteaz için maruz. Bölünme sonra floresan gazetecilere serbest bırakılır ve IONP üzerinde uncleaved yüzeylerde vücutta kalır kendi küçük boyutu nedeniyle idrar içine, filtre uygulanır. Bu nedenle, proteaz faaliyetleri vivo içinde artış bir muhabir için idrar (Şekil 1) daha yüksek konsantrasyonlarda neden olur. Bizim idrar testi platformdur, hiçbir görüntüleme platformu gereklidir ve tanılama sinyalleri idrarda zenginleştirilmiş.
Bu platform hastalıkları kanser, fibrozis ve tromboz13,14dahil olmak üzere çeşitli algılamak için tasarlanmış. Burada yükselmeler matris metallopeptidaz 9 (MMP9) tespit etmek için nanosensors tasarımını açıklamak bir biyomarker kolorektal kanser olarak faaliyet. Kolorektal kanser kanser ölüm ikinci önde gelen nedenidir bir tahmini 136,800 Yeni olgu ve 2014 yalnız15dakika sonra 50,300 ölümlerini ile Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. Kolorektal tümör hücreleri malign ilerleme, matris bozulması gibi metastaz16sürücü için gösterilen MMP9 üretmek. Ayrıca, biz edebiyat17MMP9 için uygun peptid substrat (PLGVRGK) tespit. Bu platform erken kanser teşhis ve düşük maliyetli bakım noktası tanılama13,14,18,19,20,21için kullanılabilir.
Şekil 1: Nanosensor aktivite içinde vivoşematik. Nanosensors vücuda geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve hastalık sitelere yerelleştirilmesine. O zaman, proteaz hastalığı ile ilgili IONPs tarafından sunulan peptid yüzeylerde ayırmak. Renal izni, onları idrarda yerelleştirmek neden i ciddi parçaları boyutunu sağlar. Hayvan idrara sonra bu peptid parçaları kendi muhabir molekül tarafından çözümlenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem bir nanopartikül çekirdek Birleşik proteaz yüzeylerde oluşan etkinlik tabanlı nanosensors gelişimi anlatılmaktadır. Çünkü i ciddi peptid ürünleri böbrek filtrasyon boyutunda 5 nm23 ve noninvaziv bir sinyal üretmek için idrar içine filtre daha küçük olay proteolitik dekolte “farmakokinetik anahtarı” lakaplı. Bu nedenle, 5’ten daha büyük bir hidrodinamik RADIUS içeren nano tanecikleri veya taşıyıcıları kullanmak önemlidir nm, daha küçük bir şey gibi hı…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bir NIH yönetmenin yeni yenilikçi Ödülü (Ödülü No tarafından finanse edildi DP2HD091793). Q.D.M. NSF yüksek lisans araştırma bursu Program tarafından (Grant No desteklenir DGE-1650044). B.A.H Georgia Tech Başkan’ın bursu yanı sıra ulusal kurumları sağlık GT BioMAT eğitim Grant’ın ödülü numarası 5T32EB006343 altında tarafından desteklenir. G.A.K. tutar bir kariyer Ödülü Burroughs hoş geldiniz fondan bilimsel arayüz. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| 0.2 µm syringe filters | VWR | 4652 | |
| 18G needle | VWR | 89134-024 | |
| 15 mL conicals | VWR | 89039-670 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-362 | |
| Stir bar | VWR | 58949-006 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 97064-482 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma | 236489 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 44939 | |
| Epichlorohydrin | Sigma | 45340-500ML-F | |
| DMF | Sigma | D4551 | |
| Ammonium Hydroxide | Sigma | 320145-500ML | |
| Sodium Hydroxide pellets | Sigma | 221465-500G | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Sodium Borate | Sigma | B9876 | |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-100G | |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk | Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| Fluorescein Antibody [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| Plate Reader | Fisher | BTCYT5M | |
| BD Insulin Syringes | Fisher | NC0872854 |
Referências
- Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
- Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).
- Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).
- Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).
- Jin, H., et al. Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications. Scientific Reports. 3, 2140 (2013).
- Ma, W., Liu, H. -. T., Long, Y. -. T. Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).
- Zhang, W. -. H., Ma, W., Long, Y. -. T. Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots. Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).
- Ma, W., et al. Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system. Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).
- Holt, B. A., et al. Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity. Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).
- Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).
- Kleifeld, O., et al. Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates. Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).
- Sanman, L. E., Bogyo, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).
- Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts. Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).
- Meester, R. G. S., et al. Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018. Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).
- Mehner, C., et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).
- Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).
- Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity. ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).
- Palmacci, S., Josephson, L. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , (1991).
- Choi, H. S., et al. Renal clearance of nanoparticles. Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).
- Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly. Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).
- Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).
- Villanueva, J., et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).
