بدء نشاط Ictal الحادة في القوارض والأنسجة البشرية الجيل وبناء على الطلب
Summary
نماذج الاستيلاء الحادة هامة لدراسة الآليات الكامنة وراء الأحداث صرعية. وعلاوة على ذلك، يوفر القدرة على توليد أحداث صرعية عند الطلب طريقة ذات كفاءة عالية لدراسة تسلسل الأحداث الكامنة وراء مبادرتهم. وهنا يصف لنا نماذج الاستيلاء القشرية 4-أمينوبيريديني الحاد في الماوس والأنسجة البشرية.
Abstract
السيطرة على المضبوطات لا تزال قضية تمثل تحديا للمجتمع الطبي. لإحراز تقدم، يحتاج الباحثون طريقة لدراسة ديناميات الاستيلاء على نطاق واسع والتحقيق في آلياتها الأساسية. نماذج الاستيلاء الحادة هي مريحة وتوفر القدرة على إجراء التسجيلات الكهربية ويمكن أن تولد كمية كبيرة من اليكتروجرافيك مثل الاستيلاء على الأحداث (إيكتال). ثم يمكن أن تكون متقدمة نتائج واعدة من نماذج الاستيلاء على حدة نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية. وهكذا، ستكون ضرورية لجعل النتائج ذات الصلة سريرياً دراسة المضبوطات في نماذج الحادة التي تحاكي إخلاص توقيعات الاستيلاء على السريرية اليكتروجرافيك والديناميكية. دراسة الأحداث إيكتال في نماذج الحادة مصادرة إعداد من الأنسجة البشرية مهم أيضا لجعل النتائج ذات الصلة سريرياً. التركيز الرئيسي في هذه الورقة في النموذج 4-AP القشرية بسبب متعددة الاستعمالات في توليد الأحداث إيكتال في الدراسات في فيفو و في المختبر وكذلك في الماوس والأنسجة البشرية. كما وصف طريقة بديلة للاستيلاء على الاستقراء باستخدام نموذج2 + صفر-مغ الطرق الواردة في هذه الورقة ويقدم عرضاً مفصلاً للمزايا والقيود المفروضة على النشاط مثل صرعية التي تم إنشاؤها في مختلف الحادة نماذج الاستيلاء. وعلاوة على ذلك، بالاستفادة من أوبتوجينيتيك المتاحة تجارياً في سلالات الماوس، يمكن استخدام نبضة خفيفة قصيرة (30 مللي ثانية) لتشغيل حدث ictal مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً. وبالمثل، يمكن تطبيق نفث العصبية (زبدي حمض غاما الأمينية أو غلوتامات) 30-100 مللي ثانية للأنسجة البشرية لتحريك الأحداث إيكتال التي تكون مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً. القدرة على تحريك الأحداث إيكتال على الطلب في نماذج الاستيلاء الحادة يوفر القدرة المكتشف حديثا لمراقبة تسلسل الأحداث التي تكمن وراء الاستيلاء على الشروع في ديناميات وتقييم كفاءة العلاجات المضادة الاستيلاء المحتملة.
Introduction
يمكنك استخراج نماذج الاستيلاء على حدة بنجاح تذكرنا الأحداث إيكتال التي لوحظت في للالكهربائي (EEG) للأفراد التي تعاني من الاستيلاء على اليكتروجرافيك التواقيع. الباحثين استخدام هذه الأحداث مثل إيكتال (يشار إليها هنا ‘أحداث ictal’) كالأمهات البديلات للاستيلاء على حدث1. سريرياً، كأحداث ictal وكيل موثوق بها للاستيلاء على الأحداث منذ المضبوطات هي اضطراب عصبي التي تنشأ من الدماغ. في وحدة مراقبة الصرع، أطباء الأعصاب تعتمد على الكشف عن الأحداث ictal للتأكد من منطقة ابيليبتوجينيك في الدماغ وعزلها لاستئصال2. في وحدة العناية المركزة، رصد الأطباء النشاط ictal تقييم ما إذا كان أي نشاط حجز تصر على المرضى مخدراً3. السيطرة على المضبوطات لا يزال يتعين قضية التي تمثل تحديا للمجتمع الطبي، كما أن 30% مرضى الصرع المقاومة للأدوية لأن الأدوية المتوفرة4،5، و 10 في المائة من الحالات الطبية التي تنطوي على مضبوطات المخدرات التي يسببها لا يستجيب ل العلاج القياسي3. وهذا يعرض يشكل مصدر قلق للمجتمع، كما المنظورة هو 10 في المائة سكان أمريكا تعاني من الاستيلاء على الأحداث في حياتهم و 3% ومن المتوقع وضع الصرع6.
دراسة المضبوطات في نماذج الصرع المزمن هو مكلفة وشاقة، وغالباً ما يستغرق شهورا لإعداد7. كما أن من الصعب إجراء التسجيلات الكهربية في الانتقال بحرية الحيوانات. التجارب السريرية البشرية تواجه قضايا مماثلة، فضلا عن تعقيدات إضافية تتصل بموافقة المريض، تقلب في خلفيات المشاركين و اعتبارات أخلاقية وتشارك8. من ناحية أخرى، نماذج الاستيلاء على حدة، مواتية لأنها ملائمة لإعداد نسبيا وفعالة من حيث التكلفة، وقادرة على توليد كميات كبيرة من الأحداث ictal لدراسة9. بالإضافة إلى ذلك، تم إصلاح الأنسجة في وضع مستقر، حتى الظروف تعتبر مثالية لإجراء التسجيلات الكهربية اللازمة لدراسة ديناميات الاستيلاء والفسيولوجيا المرضية الأساسية ذات الصلة. نماذج الاستيلاء على حدة تظل مواتية أكثر من نماذج في السيليكون (الكمبيوتر) نظراً لأنها تعتمد على المواد البيولوجية ويتألف من شبكة الخلايا العصبية المكونة للدماغ مع جميع العوامل الكامنة والربط متشابك، وأن لم يتم القبض على باستخدام الكمبيوتر حتى أكثر تفصيلاً ونماذج10. هذه الميزات لجعل نماذج الحادة الاستيلاء على وشك أن تكون فعالة في الكشف عن العلاجات المضادة مصادرة المحتملة وجعل النتائج الأولية قبل دفع لهم لإجراء مزيد من التحقيقات في نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية.
بشكل عام، نماذج الاستيلاء الحادة مستمدة من أنسجة المخ المعتادة التي قد تعرض لظروف فرط منفعل. للحث على أحداث ictal ذات الصلة سريرياً في أنسجة المخ السليمة، من المهم أن نفهم أن الدماغ يعمل على النحو الأمثل في حالة حرجة11 متوازنة12فيها الإثارة (ه) وتثبيط (ط). حدوث اضطراب في ه–أنا التوازن يمكن أن يؤدي إلى فرط منفعل الاستيلاء على الدولة التي تتسبب في أحداث إيكتال. وبناء على ذلك، ضمن هذا الإطار المفاهيمي، هناك اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية لتوليد أحداث ictal شرائح المخ (في المختبر) أو في الأعمال التحضيرية للجامعة في الدماغ (في فيفو): زادت أو انخفضت تثبيط (“إزالة التثبيط”) الإثارة (“غير-إزالة التثبيط”). بيد أن الأحداث ictal مرتبة عالية وتزامن الأحداث التي تتطلب تأثير إينتيرنيورونس جابايرجيك الانسجام في نشاط شبكات عصبونية13،14. ولهذا السبب، نماذج غير إزالة التثبيط هي الأكثر فعالية لتوليد الأحداث إيكتال في الشبكات العصبية معزولة، مثل في في المختبر شريحة الدماغ15، بينما في المختبر نماذج إزالة التثبيط يؤدي عادة إلى النتوءات النشاط تذكر النتوءات الشبيهة إينتيريكتال. وعلاوة على ذلك، ضمن هذا الإطار المفاهيمي، حدث أثناء مزامنة لحظة يمكن أن تؤدي إلى أيضا موثوق حدث إيكتال16. وفي الواقع، حدث ictal يمكن أن تحدثها أي اضطراب طفيف المطبقة على الجهاز العصبي17 عندما يكون في نقطة انتقال (“التشعب”) حالة حرجة18. تقليديا، كانت هذه الاضطرابات الناجمة عن التحفيز الكهربائي. لكن التطورات الأخيرة التي أوبتوجينيتيكس في علم الأعصاب، يوفر الآن استراتيجية أكثر أناقة لحمل الدولة الحيوية انتقالات16.
الطرق الموضحة في هذه الورقة لشرح كيفية توليد أحداث ictal على الطلب في نماذج الاستيلاء الحادة في المختبر (الخطوة 1 من البروتوكول) ودراسات في فيفو (الخطوة 2 من البروتوكول). أنها تنطوي على اختيار منطقة الدماغ والاستيلاء على أسلوب الحث ونوع الدراسة والأنواع؛ ومع ذلك، سينصب على اختيار نموذج حادة 4-AP القشرية الاستيلاء الموصى بها بسبب متعددة الاستعمالات في مجموعة متنوعة واسعة من أنواع الدراسة. يقوم نموذج الاستيلاء على 4-AP الحادة في المختبر على بروتوكول قياسي لإعداد شرائح الدماغ عالية الجودة للتسجيلات الكهربية وتصوير الدراسات19. قد استخدمت فعلا هذه البروتوكولات لجعل الشرائح في المختبر الدماغ الاكليلية من قشرة سوماتوسينسوري والحركية للفئران16،البشر و20 21. تعديلات لتوليد الأحداث إيكتال في هذه الأنواع من شرائح المخ سابقا ثبتت16 والتفاصيل الكاملة موصوفة في بروتوكول أدناه. نموذج 4-AP القشرية الاستيلاء الحادة في فيفو يستند إلى بروتوكول قياسي لإعداد اوديما للتصوير الدراسات22. التعديل أن أي إطار (الشريحة الزجاجية) مثبت بعد اوديما. بدلاً من ذلك، وكلاء بروكونفولسانت (4-أ فب) تطبق موضعياً على قشرة المكشوفة للحث على أحداث ictal بينما الحيوان تحت التخدير العام. على حد علمنا، كان لدينا فريق الأول من وضع هذا الحاد في فيفو الاستيلاء القشرية النموذجي في الفئران16،23. الحاد في فيفو الاستيلاء القشرية 4-AP نموذج إعداد من الفئران الكبار وضعت استكمالا لنموذج شريحة في المختبر من نسيج الأحداث. النسخ المتماثل للنتائج التي توصل إليها في نموذج الحجز الكبار في فيفو يساعد على تعميم النتائج المستخلصة من نماذج شريحة بمعالجة الشواغل الكامنة فيما يتعلق بالشروط غير الفسيولوجية شريحة الدماغ 2D (مقابل ثلاثي الجامعة في الدماغ الهيكل) والاختلافات الفسيولوجية بين الأحداث والبالغين الأنسجة.
ويتضح طريقة بدء الحدث إيكتال عند الطلب باستخدام أما نفث العصبية مع استراتيجيات بيكوسبريتزير أو أوبتوجينيتيك. على حد علمنا، مجموعتنا هو الأول من بدء الأحداث إيكتال في الأنسجة البشرية باستخدام أجهزة الإرسال العصبية عبر بيكوسبريتزير16. استراتيجيات أوبتوجينيتيك، من سلالة الفئران C57BL/6 سلالة التقليدية المستخدمة للتعبير عن المتسلسلات. التعبير عن تشانيلرهودوبسين-2 (ChR2) في إينتيرنيورونس جابايرجيك أو جلوتاماتيرجيك الخلايا الهرمية سيوفر القدرة الاختيارية على توليد أحداث ictal على الطلب مع نبضات خفيفة قصيرة. سلالات الفئران أوبتوجينيتيك مناسبة تشمل متغير C57BL/6 المتاحة تجارياً التي تعرب عن ChR2 في إينتيرنيورونس، أما باستخدام الماوس حويصلية غابا الناقل بروموتور (فجأت)24، أو الخلايا الهرمية، باستخدام مستضد خلايا الغدة الصعترية الماوس 1 مروج (Thy1)25. هذه الفئران ChR2 فجأت و Thy1-ChR2 المتاحة تجارياً تتيح الفرصة لتنشيط الخلايا العصبية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك، على التوالي، في اللحاء الجديد مع الأزرق (470 nm) الضوء. القدرة على توليد أحداث ictal على الطلب في نماذج الاستيلاء الحاد يمكن أن تقدم فرصاً جديدة دراسة ديناميات الشروع في ضبط وتقييم كفاءة العلاجات المضادة الاستيلاء المحتملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
شرائح المخ يعالجون بدواء بروكونفولسانت أو تغيير بيرفوساتي قام زيادة استثارة الشبكة العصبية والنهوض هطول الأمطار لإحداث إيكتال (أحداث شبيهة بالاستيلاء على اليكتروجرافيك). للفئران، ينبغي أن تحتوي على شرائح الاكليلية المفضل من منطقة somatosensory موتور القشرة cingulate، المنطقة 2 (CG)، ولكن ليس في منط?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (119603 باتاكا بيتر لام كارلين وتوفيق فلينت ألف)، ومعهد الدماغ أونتاريو (لتوفيق فلينت ألف)، ومنح البحوث الطلابية ميتش (لمايكل تشانغ). نود أن نشكر ليام طويلة لمساعدته في تصوير المخطوطة الفيديو. ونود أن نعترف باهاريخوب باريا، سيلفاباسكاران أبيشان، وشاديني الملاصقتين لمساعدتها في تجميع الأرقام والجداول في هذه المخطوطة. هي الأرقام 1A 3A, 4Aو 6A جميع الأرقام الأصلية من البيانات المنشورة في تشانغ et al. 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
