Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Summary

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Abstract

Anfälle zu kontrollieren, bleibt eine Herausforderung für die Ärzteschaft. Um voranzukommen, brauchen die Forscher einen Weg, um ausgiebig studieren Beschlagnahme Dynamik und ihre zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Akuter Anfall Modelle sind bequem, bieten die Möglichkeit, elektrophysiologische Aufnahmen durchzuführen und können eine große Menge von elektrographischen Beschlagnahme-ähnliche (iktalen) Ereignisse generieren. Die vielversprechenden Ergebnisse aus akuten Anfall Modelle können dann zu chronischen Epilepsie Modelle und klinische Studien vorgeschoben werden. So werden studieren Anfälle bei akuten Modelle, die treu die elektrographischen und dynamischen Signaturen eines klinischen Anfalls replizieren für klinisch relevante Ergebnisse. Studieren iktale Veranstaltungen im akuten Anfall Modelle aus menschlichem Gewebe vorbereitet ist auch wichtig für die Herstellung von Erkenntnissen, die klinisch relevant sind. Der Schwerpunkt in diesem Papier ist auf der kortikalen 4-AP-Modell aufgrund seiner Vielseitigkeit in iktalen Ereignisse generieren, in Vivo und in Vitro Studien, sowie Maus und menschlichem Gewebe. Die Methoden in diesem Papier werden auch ein alternatives Verfahren zur Beschlagnahme Induktion mit dem Null-Mg^{2 +} Modell zu beschreiben und bieten einen detaillierten Überblick über die Vorteile und Grenzen der epileptiformen-ähnliche Aktivität erzeugt in den verschiedenen akuten Beschlagnahme-Modelle. Darüber hinaus kann unter Ausnutzung der im Handel erhältlichen optogenetische Mausstämme, eine kurze (30 ms) Lichtpuls zum Auslösen eines iktalen identisch mit denen spontan auftretenden Ereignisses verwendet werden. 30-100 ms Puffs von Neurotransmittern (Gamma-Aminobuttersäure oder Glutamat) können ebenso genutzt werden, um das menschliche Gewebe iktalen Ereignisse ausgelöst, die den spontan auftretenden übereinstimmen. Die neu gewonnene Fähigkeit, die genaue Abfolge der Ereignisse zu beobachten, die Beschlagnahme Einleitung Dynamik zugrunde liegen und effizient bewerten mögliche Anti-Anfall Therapien bietet die Möglichkeit, iktale Ereignisse auf Abruf im akuten Anfall Modelle auslösen.

Introduction

Akuten Anfall Modelle können erfolgreich reproduzieren elektrographischen Signaturen erinnert an iktalen Ereignisse beobachtet im Elektroenzephalogramm (EEG) von Personen, die einen Anfall zu erleben. Forscher verwenden diese iktalen-ähnliche Ereignisse (im folgenden als “iktale Events” bezeichnet) als Surrogate für die Beschlagnahme Event¹. Klinisch, dienen iktale Ereignisse als zuverlässige Proxy für Anfallsgeschehen da Anfälle eine neurologische Erkrankung handelt, die aus dem Gehirn stammen. In der Epilepsie-Überwachungseinheit verlassen Neurologen auf die Erkennung von iktalen Veranstaltungen zum epileptogenen Hirnregion bestätigen und isolieren es für Resektion². In der Intensivstation überwachen Ärzte iktale Aktivität zu beurteilen, ob Anfallsaktivität in sedierten Patienten³fortbesteht. Anfälle zu kontrollieren, bleibt eine Herausforderung für die Ärzteschaft, da 30 % der Epilepsiepatienten Medikament resistent gegen die verfügbaren Medikamente^4,5, und 10 % der medizinischen Fällen, in denen Arzneimittel-induzierte Anfälle sind reagiert nicht auf die standard-Behandlung-³. Dies stellt ein ernstes Problem für die Gesellschaft, wie 10 % der amerikanischen Bevölkerung um eine Beschlagnahme Ereignis in ihrem Leben erleben prospektiert und 3 ist % werden voraussichtlich Epilepsie⁶zu entwickeln.

Anfälle bei chronischer Epilepsie Modelle zu studieren ist teuer, aufwändig und oft Monate dauern, bis⁷vorzubereiten. Es ist auch schwierig, elektrophysiologische Aufnahmen in frei beweglichen Tieren durchzuführen. Klinische Studien am Menschen stehen ähnliche Probleme sowie zusätzliche Komplexität im Zusammenhang mit Zustimmung des Patienten, Variabilität der TeilnehmerInnen Hintergründe und die moralischen und ethischen Überlegungen beteiligt⁸. Akuten Anfall Modelle sind auf der anderen Seite günstig, weil sie relativ bequem zu bereiten, kosteneffiziente und erzeugen große Mengen an iktalen Veranstaltungen für Studie⁹sind. Darüber hinaus ist das Gewebe in einer stabilen Position fixiert, so sind die Bedingungen ideal für die Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahmen notwendig Beschlagnahme Dynamik und der damit verbundenen zugrunde liegende Pathophysiologie zu erforschen. Akuter Anfall Modelle bleiben günstig über in Silico (Computer) Modelle, denn sie basieren auf biologisches Material bestehend aus das Gehirn konstituierenden neuronalen Netzwerk mit all seinen inhärenten Faktoren und synaptischen Verbindungen, die nicht erfasst werden können auch die detaillierte Computer Modelle¹⁰. Diese Eigenschaften machen akuten Anfall Modelle bereit, effizientes screening auf mögliche Anti-Anfall-Therapien und die vorläufigen Ergebnisse vor voran sie zur weiteren Untersuchung in chronischen Epilepsie Modelle und klinische Studien werden.

Akuten Anfall Modelle werden in der Regel aus der normalen Hirngewebe abgeleitet, die hyper-erregbare Bedingungen ausgesetzt war. Klinisch relevante iktale Veranstaltungen in gesunden Hirngewebe zu induzieren, ist es wichtig zu verstehen, dass das Gehirn optimal funktioniert in einem kritischen Zustand¹¹ wo Erregung (E) und Hemmung (I) sind ausgewogene¹². Eine Störung des E-ich Gleichgewicht zu den hyper-erregbare Beschlagnahme Zustand in dem iktalen Ereignisse überstürzen führen kann. Entsprechend dieser konzeptionellen Rahmen gibt es zwei wichtige Strategien zur iktale Veranstaltungen im Gehirnscheiben (in Vitro) oder im gesamten Gehirn (in Vivo) Vorbereitungen generieren: Hemmung (“Enthemmung”) verringert oder erhöht Erregung (“nicht-Enthemmung”). Jedoch iktalen Ereignisse sind sehr geordnet und Ereignisse, die den Einfluss der GABAergen Interneuronen, die neuronale Aktivität^13,14orchestrieren erfordern synchronisiert. Aus diesem Grund sind nicht Enthemmung Modelle die wirksamsten für generieren von iktalen Ereignissen in isolierten neuronale Netze, wie z. B. in einem in-vitro- Gehirn schneiden¹⁵, während in Vitro Enthemmung Modelle führen häufig zu Spick Aktivität erinnert mich an interiktale erinnernde Spick. Darüber hinaus kann eine momentane Synchronisierung Ereignis in dieser konzeptuellen Rahmen auch zuverlässig eine iktalen Veranstaltung¹⁶auslösen. In der Tat kann ein iktalen Ereignis ausgelöst werden, durch jede kleine Störung auf das neurale System¹⁷ angewendet, wenn es um einen kritischen Zustand Übergang (“Bifurkation”) Punkt¹⁸ist. Traditionell wurden diese Störungen durch elektrische Stimulation induziert. Die jüngste Entwicklung der Optogenetik in den Neurowissenschaften, bietet jedoch nun eine elegantere Strategie zur kritischen Zustand Übergänge¹⁶induzieren.

In diesem Artikel beschriebenen Methoden veranschaulichen die iktale Ereignisse auf Abruf im akuten Anfall Modelle für in Vitro (Schritt 1 des Protokolls) und in Vivo Studien (Schritt 2 des Protokolls) zu generieren. Sie beinhalten die Wahl der Region des Gehirns, Beschlagnahme Induktionsmethode Studientyp und Arten; im Mittelpunkt werden jedoch auf die empfohlene Wahl eines akuten 4-AP kortikalen Beschlagnahme-Modells wegen seiner Vielseitigkeit in einer Vielzahl von Studientypen. Die akute in-vitro- 4-AP Anfall Modell basiert auf dem Standardprotokoll zur elektrophysiologischen Aufzeichnungen qualitativ hochwertige Gehirnscheiben Vorbereitung und bildgebende Studien¹⁹. Diese Protokolle wurden bereits zur in-vitro- koronalen Hirnschnitten von somatosensorischen motorischen Kortex von Mäusen^16,Menschen und^{20 21}zu machen. Änderungen in diesen Arten von Gehirnscheiben iktalen Ereignisse generiert wurden zuvor nachgewiesen,¹⁶ und die vollständigen Angaben im Protokoll unten beschrieben werden. Akuten in Vivo kortikalen Beschlagnahme 4-AP-Modell basiert auf dem Standardprotokoll darauf vorzubereiten, dass eine Kraniotomie bildgebende Studien²². Die Änderung ist, dass kein (Objektträger) Fenster nach der Kraniotomie installiert ist. Stattdessen sind proconvulsant Mittel (4-AP) topisch angewendet, der exponierten Kortex induzieren iktalen Ereignisse, während das Tier unter Vollnarkose ist. Unseres Wissens war unserer Gruppe der erste dieser akuten in Vivo kortikalen Beschlagnahme-Modell in Mäusen^16,23zu entwickeln. Die akute in Vivo 4-AP kortikalen Beschlagnahme vorbereitete Modell von Erwachsenen Mäusen wurde entwickelt, um die in-vitro- Slice-Modell von juvenile Gewebe zu ergänzen. Die Replikation der Ergebnisse in den Erwachsenen in Vivo Beschlagnahme-Modell hilft, um die Ergebnisse von Slice-Modellen zu verallgemeinern, von inhärenten Bedenken hinsichtlich der unphysiologischen Bedingungen einer 2D Gehirn-Scheibe (im Vergleich zu einem 3-d ganz-Gehirn Struktur) und die physiologischen Unterschiede zwischen juvenilen und adulten Gewebes.

Die Methode der bedarfsgesteuerte iktalen Veranstaltung Einleitung wird demonstriert mit entweder Puffs von Neurotransmitter mit Picospritzer oder optogenetische Strategien. Nach bestem Wissen und gewissen ist unsere Fraktion der erste, der im menschlichen Gewebe mittels Neurotransmitter über einen Picospritzer¹⁶iktalen Ereignisse auslösen. Optogenetische Strategien ist die C57BL/6 Mäusen Belastung der konventionellen Belastung für transgene Ausdruck verwendet. Die Expression des Channelrhodopsin-2 (ChR2) in GABAergen Interneuronen oder glutamatergen Pyramidenzellen bieten die optionale Möglichkeit, iktale Ereignisse bei Bedarf kurze Lichtpulse erzeugen. Geeignete optogenetische Mäuse Stämme gehören die im Handel erhältliche C57BL/6-Variante, die ChR2 in beiden Interneuronen, mit der Maus vesikuläre GABA-Transporter promotor (VGAT)²⁴oder Pyramidenzellen, mit der Maus-Thymus-Zell-Antigen 1 drückt Promotor (Thy1)²⁵. Diese handelsüblichen VGAT-ChR2 und Thy1-ChR2 Mäuse bieten die Möglichkeit, GABAergen Neuronen oder glutamatergen Neuronen in der Großhirnrinde mit blau bzw. aktivieren (470 nm) Licht. Die Fähigkeit, iktale Events auf Abruf im akuten Anfall Modelle generieren kann neuartige Möglichkeiten zur Beschlagnahme Einleitung Dynamik zu studieren und effizient bewerten mögliche Anti-Anfall Therapien anbieten.

Protocol

Alle Forschung an Patienten wurde unter ein Protokoll genehmigt durch University Health Network Research Ethik Board in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Verfahren, bei denen Tiere wurden im Einklang mit den Leitlinien des Canadian Council on Animal Care und von Krembil Research Institute Animal Care Committee genehmigt. 1. Protokoll I: akut In Vitro Modell der Beschlagnahme Vorbereitung der Dissektion Lösungen und künstliche Liquor c…

Representative Results

Die Anwendung von 100 µM 4-AP, gute Qualität (unbeschädigt) 450 µm Größe kortikalen Gehirnscheiben aus eine juvenile VGAT-ChR2 zuverlässig induzierte wiederkehrende iktalen Mausereignisse (> 5 s) innerhalb von 15 min (Abbildung 1Ai). Die Anwendung von 100 µM 4-AP auf Scheiben von schlechter Qualität führte zu platzen Ereignisse oder Spick Aktivität (Abbildung 1Aii). Durchschnittlich 40 % der Scheiben von jeder seziert …

Discussion

Die Gehirnscheiben werden mit ein proconvulsant Medikament oder eine veränderte ACFS Perfusat die neuronale Erregbarkeit erhöhen und fördern einen Niederschlag von iktalen Veranstaltungen (elektrographischen Beschlagnahme-ähnliche) behandelt. Für Mäuse sollte die bevorzugte koronalen Scheiben des Bereichs somatosensorischen Motor cingulären Kortex, Bereich 2 (CG), nicht aber die Retrosplenial (RS); Diese anatomischen Markierungen helfen, das Spektrum der koronalen Scheiben zu identifizieren, die am besten zur Indu…

Materials

Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store