설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시
Summary
급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.
Abstract
발작을 제어 의료 사회에 대 한 도전적인 문제에 남아 있다. 진행을 하려면 연구원은 광범위 하 게 발작 역학을 연구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘을 조사 하는 방법이 필요 합니다. 급성 발작 모델 편리, electrophysiological 녹음을 수행 하는 기능을 제공 하 고 electrographic 발작 같은 (ictal) 이벤트의 큰 볼륨을 생성할 수 있습니다. 급성 발작 모델에서 유망한 결과 만성 간 질 모델 및 임상 시험을 다음 고급 수 있습니다. 따라서, 급성 모델을 충실 하 게 복제 한 임상의 electrographic 및 동적 서명에서 발작을 공부 하 고 임상 관련 연구 결과 만들기 위한 필수적인 것. 인간 조직에서 준비 하는 급성 발작 모델에서 ictal 이벤트 공부도 임상적으로 관련 된 연구 결과 만들기 위한 중요 하다. 이 문서의 주요 초점이 이다 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구 뿐만 아니라 마우스 및 인간의 조직 ictal 이벤트 생성에 그것의 다양성으로 인해 대뇌 피 질 4 AP 모델에. 이 문서에 메서드 또한 0 Mg2 + 모델을 사용 하 여 나포 유도의 다른 방법에 설명 하 고 제공 하는 장점에 대 한 자세한 개요와 다른 생성 된 epileptiform 같은 활동의 한계 급성 발작 모델입니다. 또한, 이용 하 여 상업적으로 이용 가능한 optogenetic의 마우스 긴장, 짧은 (30 ms) 빛 펄스 ictal 이벤트 저절로 발생 동일 하 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 감마 아미노 버터 산 (조미료) 신경 전달 물질의 30-100 ms 퍼프 ictal 이벤트를 동일 저절로 발생 하는 트리거를 인간의 조직에 적용할 수 있습니다. Ictal 이벤트 요청 시 급성 발작 모델에 트리거 수 발작 개시 역학 기초 및 잠재적인 안티 발작 치료를 효율적으로 평가 하는 이벤트의 정확한 순서를 관찰 하는 새로운 기능을 제공 합니다.
Introduction
급성 발작 모델 성공적으로 electrographic 서명 ictal 이벤트 발작을 경험 하는 개인의 뇌 파 (EEG)에의 연상을 재현할 수 있습니다. 연구원은 대리 모 알선으로 이러한 ictal 같은 이벤트 (여기 ‘ictal 이벤트’ 라고 함)을 사용 하 여 발작 이벤트1. 임상, ictal 이벤트 발작 이벤트에 대 한 신뢰할 수 있는 프록시 이후 발작 신경 장애는 뇌에서 발생 하는 역할. 간 질 모니터링 장치, 신경과 두뇌의 epileptogenic 영역을 확인 하 고 절제2격리 ictal 이벤트 감지 시 의존 합니다. 집중 치료 단위에 의사 ictal 활동 평가 진정 환자3에서 지속 되는 발작 활동을 모니터링 합니다. 간 질 환자의 30%는 사용 가능한 약물4,5, 저항 하는 마약 및 약물 유발 발작을 포함 하는 의학 케이스의 10%는 의료 사회에 대 한 도전적인 문제 될 남아 발작을 제어 3표준 치료 응답 하지 않는. 이 미국 인구의 10%는 prospected 그들의 일생에서 한 발작 이벤트를 경험 하 고 3%는 간 질6를 개발 것으로 예상 된다, 사회에 대 한 심각한 우려를 제공 합니다.
만성 간 질 모델에서 발작을 공부 하 고 비싼, 힘 드는, 이며 종종 준비7개월 걸릴. 또한 자유롭게 이동 하는 동물에 electrophysiological 녹음을 수행 하기가 어렵습니다. 인간 임상 시험 추가 복잡 한 환자 동의 참가자 들의 배경과 도덕적이 고 윤리적인 고려 사항 관련된8에 변화에 관련 된로 서 비슷한 문제, 직면 한다. 급성 발작 모델, 다른 한편으로은 유리한 그들은 상대적으로 비용 효율적인 준비를 편리 하 고 많은 양의 연구9ictal 이벤트를 생성할 수 있기 때문에. 또한, 그래서 조건이 발작 역학과 관련 된 기본 이상 공부 하는 데 필요한 electrophysiological 녹음을 수행 하기 위한 이상적인 조직 안정 된 위치에 고정 됩니다. 그들은 생물 학적 재료 모든 고유한 요소 및 캡처할 수 있는 시 냅 스 연결 두뇌의 구성 신경 네트워크의 구성에 기반으로 하기 때문에 급성 발작 모델에 철에 (컴퓨터) 모델을 통해 유리한 유지 심지어는 가장 상세한 컴퓨터에 의해10모델. 이러한 기능을 효율적으로 잠재적인 안티 발작 치료에 대 한 검사 및 만성 간 질 모델 및 임상 시험에서 추가 조사를 위해 그들을 전진 하기 전에 예비 결과 만드는 것을 급성 발작 모델 있습니다.
일반적으로 급성 발작 모델 하이퍼 고르기 조건에 복종 된 정상 뇌 조직에서 파생 됩니다. 건강 한 뇌 조직에 임상 관련 ictal 이벤트를 유도, 그것은 두뇌 위험 상태11 에서 최적으로 기능을 이해 하는 것이 중요 여기 (E)와 (I) 억제 있는 균형된12. E의 중단-내가 균형 ictal 이벤트 침전 하이퍼 고르기 발작 상태로 이어질 수 있습니다. 따라서,이 개념 프레임 워크 내에서 두 가지 주요 전략 두뇌에서 분할 영역 (생체 외에서) 또는 (vivo에서) 모든 두뇌 준비 ictal 이벤트를 생성: 억제 (“disinhibition”) 감소 또는 증가 여기 (“비-disinhibition”)입니다. 그러나, ictal 이벤트는 매우 주문 하 고 이벤트를 통합 하는 신경 네트워크 활동13,14GABAergic 수의 영향을 필요로 하는 동기화. 이러한 이유로 비 disinhibition 모델은 격리 된 신경 네트워크에서 생성 ictal 이벤트에 대 한 가장 효과적인 생체 외에서 두뇌 슬라이스15, disinhibition 모델 체 외에 일반적으로 활동 급상승으로 이어질 반면 같은 interictal 처럼 급상승의 연상. 또한,이 개념적 프레임 워크 내에서 순간 동기화 이벤트를 트리거할 수 있습니다 또한 안정적으로 ictal 이벤트16. 사실, ictal 이벤트 때 위험 상태 전환 (이 하 “분기”) 포인트1817 신경 시스템 적용 된 어떤 작은 섭 동에 의해 트리거될 수 있습니다. 전통적으로,이 물결은 전기 자극에 의해 유도 했다. 그러나 신경 과학, optogenetics의 최근 개발, 지금 위험 상태 전환16유도 하 더 우아한 전략을 제공 합니다.
이 문서에서 설명 하는 방법 둘 다 생체 외에서 ( 프로토콜의 1 단계) 및 연구를 위한 vivo에서 ( 프로토콜의 2 단계) 급성 발작 모델에 주문형 ictal 이벤트를 생성 하는 방법을 보여 줍니다. 그들은 포함 하는 뇌 영역, 발작 유도 방법, 연구 유형, 및 종;의 선택 그러나, 초점은 학문 종류의 다양 한에 그 다양성으로 인해 급성 4-AP 대뇌 피 질의 발작 모델의 권장된 선택에 있을 것입니다. 급성 체 외에 4 AP 발작 모델 electrophysiological 녹음에 대 한 높은-품질 두뇌 분할 영역을 준비 하는 표준 프로토콜에 기반 하 고 이미징 연구19. 이러한 프로토콜 이미 체 외에 코로나 두뇌 분할 영역 somatosensory 모터 피 질에서 마우스16,20 와 인간21수 있도록 사용 되었습니다. 수정 이러한 유형의 뇌 조각 ictal 이벤트를 생성 하는 이전 증명16 및 상세 프로토콜 아래에 설명 되어 있습니다. 급성 vivo에서 4 AP 대뇌 피 질의 발작 모델 연구22이미징에 대 한 한 craniotomy를 준비 하는 표준 프로토콜을 기반으로 합니다. 수정 없음 (유리 슬라이드) 창에서 craniotomy를 다음 설치입니다. 대신, proconvulsant 에이전트 (4-ap = 연합 뉴스) 동물 일반 마 취는 하는 동안 ictal 이벤트를 유발 하는 노출된 피 질에 몸에 붙이기도 적용 됩니다. 우리의 지식, 우리의 그룹이 급성 vivo에서 대뇌 피 질의 발작 모델 마우스16,23에서 개발을 먼저 했다. 급성 vivo에서 4 AP 대뇌 피 질의 발작 모델 성인 쥐에서 준비 청소년 조직에서 생체 외에서 의 조각 모델을 보완 하기 위해 개발 되었다. 성인 vivo에서 발작 모델 결과의 복제 2D 두뇌 슬라이스 (대 3 차원 전체-뇌의 비 생리 적 조건에 대하여 고유한 문제를 해결 하 여 슬라이스 모델에서 연구 결과 일반화 하는 데 도움이 구조)와 청소년 및 성인 조직 간의 생리 적인 차이.
온-디맨드 ictal 이벤트 개시의 메서드는 picospritzer 또는 optogenetic 전략으로 신경 전달 물질의 어느 퍼프를 사용 하 여 보여 줍니다. 우리의 지식 최선을 다 해 우리의 그룹 사용 하 여 신경 전달 물질을 통해 picospritzer16인간의 조직에 ictal 이벤트 시작 하 처음 이다. Optogenetic 전략, C57BL/6 쥐 긴장 transgenes 표현 사용 기존의 변형이입니다. Channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic 수 또는 glutamatergic 피라미드 세포의 표현 ictal 이벤트 요청 시 짧은 광 펄스를 생성 하는 옵션 기능을 제공 합니다. 적합 한 optogenetic 쥐 긴장 마우스 기공을 GABA 전송 promotor (VGAT)24또는 마우스 thymus 세포 항 원 1를 사용 하 여 피라미드 세포를 사용 하 여 두 수에 ChR2을 표현 하는 상용 C57BL/6 변형 포함 promotor (Thy1)25. 블루와 피 질에 각각 GABAergic 신경 또는 glutamatergic 뉴런을 활성화 하는 기회를 제공 하는 이러한 상용 VGAT ChR2 및 Thy1 ChR2 마우스 (470 nm) 빛. 급성 발작 모델에 주문형 ictal 이벤트를 생성 하는 기능 발작 개시 역학을 연구 하 고 효율적으로 평가 하는 잠재적인 안티 발작 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
뇌 조각 proconvulsant 약물 또는 신경 네트워크의 흥분 성 증가 ictal 이벤트 (electrographic 발작 같은 이벤트)의 강 수를 홍보 하는 변경 된 실제 perfusate와 함께 처리 됩니다. 마우스 모터 somatosensory 영역의 기본 코로나 조각 있어야 대상 피 질, 지역 2 (CG), 그러나 retrosplenial 지역 (RS); 하지 이 해 부 마커 ictal 이벤트 유도 적합은 코로나 조각의 범위를 식별할. 두 개의 반구는 거의 동일 (비슷한 실험 단위)?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (피터 L. Carlen을 하도록 A. Valiante 119603 청소), 온타리오 뇌 연구소 (하 하도록 A. Valiante), 및 Mightex 학생 연구 그랜트 (마이클 장)에 의해 지원 되었다. 우리는 리암 긴 비디오 원고 촬영에 그의 원조에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 컴파일 수치와 테이블이이 원고에 있는 그들의 원조에 대 한 파리 Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran, 및 Shadini Dematagoda를 인정 하 고 싶습니다. 그림 1A, 3A, 4A, 6A 는 장 외 에서 출판 된 데이터에서 만든 모든 원래의 수치 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
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