Génération et sur demande d’Initiation dactivité Ictal aiguë de rongeurs et de tissus humains

Summary

Modèles de crise aiguë sont importantes pour étudier les mécanismes qui sous-tendent les manifestations épileptiformes. En outre, la capacité de générer des événements épileptiforme sur demande fournit une méthode très efficace pour étudier le déroulement exact des événements qui sous-tendent leur initiation. Nous décrivons ici les modèles de saisie corticale aiguë 4-aminopyridine établies dans la souris et de tissus humains.

Abstract

Contrôler les convulsions reste un problème épineux pour la communauté médicale. Pour progresser, les chercheurs doivent un moyen largement étudier la saisie dynamique et étudier ses mécanismes sous-jacents. Modèles de crise aiguë sont confortables et offrent la possibilité d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques peuvent générer une grande quantité d’électrographiques saisie-comme des événements (ictales). Les résultats prometteurs des modèles de crise aiguë peuvent ensuite être avancés aux modèles de l’épilepsie chronique et essais cliniques. Ainsi, étudier les saisies dans les modèles aiguës qui reproduisent fidèlement les signatures électrographiques et dynamiques d’une saisie clinique sera essentielle pour tirer des conclusions pertinentes sur le plan clinique. Études individualisées d’événements dans la crise aiguë de modèles préparés à partir de tissus humains est aussi important pour tirer des conclusions qui sont cliniquement pertinentes. Le principal but de cet article est sur le modèle 4-AP cortical en raison de sa polyvalence dans la génération d’événements ictales études tant in vivo et in vitro , ainsi que dans les souris et les tissus humains. Les méthodes dans cet article également décrira une méthode alternative d’induction de saisie en utilisant le modèle^{2 +} zéro-Mg et fournir un aperçu détaillé des avantages et les limites de l’activité épileptiforme générée dans les différents aiguë modèles de saisie. En outre, en tirant parti des optogenetic disponible dans le commerce des souches de souris, une impulsion de lumière en bref (30 ms) peut servir à déclencher un événement ictal identique à celles qui se produisent spontanément. De même, bouffées de 30 à 100 ms de neurotransmetteurs (acide Gamma-Amino butyrique ou glutamate) peuvent être appliquées au tissu humain pour déclencher des événements individualisées qui sont identiques à celles qui se produisent spontanément. La possibilité de déclencher des événements individualisées à la demande dans des modèles de crise aiguë offre la possibilité retrouvée pour observer le déroulement exact des événements qui sous-tendent la dynamique de saisie initiation et évaluer efficacement des thérapies potentielles anti-crise.

Introduction

Modèles de crise aiguë peuvent reproduire avec succès électrographiques signatures qui rappelle des événements ictales observés à l’électroencéphalographie (EEG) des individus touchés par une crise d’épilepsie. Chercheurs utilisent ces événements de type ictal (ci-après dénommés « événements ictales ») comme substituts pour la saisie d’événement¹. Cliniquement, les événements ictales font comme une approximation fiable des événements saisie puisque les saisies sont un trouble neurologique qui provient du cerveau. Dans l’unité de surveillance de l’épilepsie, neurologues s’appuient sur la détection d’événements individualisées pour confirmer la zone épileptogène du cerveau et l’isoler pour résection². Dans l’unité de soins intensifs, médecins de surveillent l’activité ictale afin d’évaluer si toute activité de crise persiste dans la sédation des patients³. Contrôle des saisies n’est toujours pas un problème épineux pour la communauté médicale, que 30 % des patients épileptiques sont multirésistante aux médicaments disponibles^4,5, et 10 % sont des cas médicaux impliquant des saisies de drogue-induite ne répond pas au traitement standard³. Cela représente une préoccupation majeure pour la société, que 10 % de la population américaine est prospecté pour vivre un événement de saisie au cours de leur vie, et 3 % sont censés développer l’épilepsie⁶.

Étudier les saisies dans les modèles d’épilepsie chronique est coûteux, laborieux et souvent prendre des mois pour préparer⁷. Il est également difficile d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques en se déplaçant librement les animaux. Des essais cliniques humains font face à des questions similaires, ainsi que les complexités supplémentaires liées au consentement du patient, la variabilité des arrière-plans des participants et les considérations morales et éthiques impliqués⁸. Modèles de crise aiguë, en revanche, sont favorables car ils sont relativement facile à préparer, rentable et capable de produire de grandes quantités d’activités individualisées pour étude⁹. En outre, le tissu est fixé dans une position stable, donc les conditions sont idéales pour effectuer les enregistrements électrophysiologiques nécessaires d’étudier la dynamique de saisie et de la physiopathologie sous-jacente connexe. Modèles de crise aiguë restent favorables par rapport aux modèles in silico (ordinateur) car ils sont basés sur du matériel biologique composée constituant réseau neuronal du cerveau avec tous ses facteurs inhérents et la connectivité synaptique, qui ne peut pas être capturée par ordinateur les plus détaillée des modèles¹⁰. Ces caractéristiques font des modèles de crise aiguë s’apprête à être efficace au préalable pour des thérapies potentielles anti-crise et tirer des conclusions préliminaires avant de les passer pour complément d’enquête dans les modèles de l’épilepsie chronique et essais cliniques.

En général, des modèles de crise aiguë sont tirées le tissu cérébral normal qui a été soumis à des conditions hyper excitables. Pour déclencher des événements ictales cliniquement pertinents dans le tissu cérébral sain, il est important de comprendre que le cerveau fonctionne de façon optimale dans un état critique¹¹ où l’excitation (E) et inhibition (I) sont équilibrés¹². Une perturbation de la E-je balance peut conduire à l’état de la saisie hyper excitables dans lequel les événements ictales précipitent. Par conséquent, dans ce cadre conceptuel, il y a deux grandes stratégies pour générer les événements individualisées dans des tranches de cerveau (in vitro) ou en préparation de l’ensemble du cerveau (in vivo) : soit une diminution de l’inhibition (« désinhibition ») soit augmenté excitation (« non-désinhibition »). Cependant, événements ictales sont classés hautement et synchronisé des événements nécessitant l’influence des interneurones GABAergiques d’orchestrer le réseau neuronal activité^13,14. Pour cette raison, les modèles non-désinhibition sont les plus efficaces pour générer les événements individualisées dans les réseaux de neurones isolés, comme dans in vitro cerveau tranche¹⁵, alors que des modèles in vitro désinhibition souvent conduisent à activité de fortification réminiscent d’interictal comme dopante. En outre, dans ce cadre conceptuel, un événement de synchronisation momentané peut déclencher aussi sûrement un événement ictal¹⁶. En fait, un événement ictal peut être déclenché par toute perturbation mineure appliquée au système neuronal¹⁷ lorsqu’il est dans un état critique de point de transition (« bifurcation »)¹⁸. Traditionnellement, ces perturbations ont été induites par la stimulation électrique. Le développement récent d’optogenetics en neurosciences, cependant, offre maintenant une stratégie plus élégante pour provoquer l’état critique de transitions¹⁶.

Les méthodes décrites dans cet article montrent comment générer des événements individualisées à la demande dans des modèles de crise aiguë pour in vitro (étape 1 du protocole) et des études in vivo (étape 2 du protocole). Elles impliquent le choix de la région du cerveau, méthode de saisie induction, type d’étude et des espèces ; Toutefois, l’accent sera mis sur le choix recommandé d’un modèle aiguë 4-AP corticale saisie en raison de sa polyvalence dans une grande variété de types d’étude. Le modèle de saisie 4-AP aiguë in vitro est basé sur le protocole standard utilisé pour préparer des coupes de cerveau de haute qualité pour des enregistrements électrophysiologiques et imagerie études¹⁹. Ces protocoles ont déjà été utilisés pour faire in vitro coronale tranches de cerveau du cortex somato-motrice des souris^16,20 et les humains²¹. Modifications pour générer les événements individualisées dans ces types de tranches de cerveau ont été démontrées précédemment¹⁶ et tous les détails sont décrits dans le protocole ci-dessous. Le modèle de saisie corticale 4-AP aiguë in vivo est basé sur le protocole standard utilisé pour préparer une craniotomie pour imagerie études²². La modification est que sans fenêtre (lame de verre) est installé après la craniotomie. Au lieu de cela, proconvulsantes agents (4-AP) sont par voie topique appliqués au cortex exposé pour induire des événements ictales tandis que l’animal est sous anesthésie générale. À notre connaissance, notre groupe a été le premier à développer ce modèle de saisie corticale aiguë in vivo dans la souris^16,23. Le modèle 4-AP saisie corticale aiguë in vivo préparé à partir de souris adultes a été développé pour compléter le modèle de tranches in vitro de tissus juvéniles. La réplication des résultats dans le modèle de saisie adultes in vivo permet de généraliser les résultats de modèles tranches en abordant les préoccupations inhérentes au sujet des conditions non physiologiques d’une tranche de cerveau 2D (par rapport à un 3-d ensemble-cerveau structure) et les différences physiologiques entre les tissus adultes et juvéniles.

La méthode d’ouverture de l’événement individualisées à la demande est démontrée à l’aide de deux bouffées de neurotransmetteurs avec une stratégies de picospritzer ou optogenetic. Au meilleur de nos connaissances, notre groupe est le premier à déclencher des événements individualisées dans les tissus humains, à l’aide de neurotransmetteurs via un picospritzer¹⁶. Stratégies d’optogenetic, la souche de souris C57BL/6 est la souche classique utilisée pour exprimer des transgènes. L’expression de channelrhodopsin-2 (ChR2) en interneurones GABAergiques ou cellules pyramidales glutamatergique fournira la possibilité en option pour générer des événements individualisées à la demande avec des impulsions de lumière brèves. Les souches de souris optogenetic appropriés sont la variante C57BL/6 disponible dans le commerce qui exprime le ChR2 en soit interneurones, à l’aide de la souris vésiculaire GABA transporter entre promoteurs (VGAT)²⁴, ou cellules pyramidales, à l’aide de l’antigène des cellules du thymus souris 1 promoteur (Thy1)²⁵. Ces souris VGAT-ChR2 et Thy1-ChR2 commercialement disponibles offrent la possibilité d’activer les neurones GABAergiques ou les neurones glutamatergiques, respectivement, dans le néocortex et le fil bleu (470 nm) lumière. La capacité de générer des événements individualisées à la demande dans des modèles de crise aiguë peut offrir de nouvelles possibilités pour étudier la dynamique de saisie initiation et évaluer efficacement des thérapies potentielles anti-crise.

Protocol

Toute recherche sur des patients a été réalisée en vertu d’un protocole approuvé par l’University Health Network Research Ethics Board conformément à la déclaration d’Helsinki. Procédures impliquant des animaux étaient conformes aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et approuvé par le Comité de protection des animaux Krembil recherche Institut. 1. le protocole I: aigu In vitro le modèle de saisie Préparation de solut…

Representative Results

L’application de 100 µM 4-AP bonne qualité (bon état) 450 µm taille de cerveau cortical des tranches d’un juvénile VGAT-ChR2 souris fiable induite ictal événements récurrents (> 5 s) moins de 15 min (Figure 1Ai). L’application de 100 µM 4-AP des tranches de mauvaise qualité a entraîné événements de rupture ou de dopage activité (Figure 1Aii). En moyenne, 40 % des tranches de chaque cerveau de souris disséqu?…

Discussion

Les tranches de cerveau sont traités avec un médicament proconvulsant ou une altération perfusat FSCA pour augmenter l’excitabilité du réseau neuronal et promouvoir une précipitation des événements ictales (événements de type saisie électrographiques). Pour les souris, les tranches coronales préférés de l’aire somato-motrice doivent contenir le cortex cingulaire, zone 2 (CG), mais pas la région retrosplenial (RS) ; ces marqueurs anatomiques aident à identifier la gamme de tranches coronales qui convi…

Materials

Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store