Generation och On-Demand inledandet av akut Ictal aktivitet i gnagare och mänsklig vävnad
Summary
Akut beslag modeller är viktiga för att studera mekanismerna bakom epileptiform händelser. Förmågan att generera epileptiform händelser på begäran ger dessutom en mycket effektiv metod för att studera det exakta händelseförloppet som ligger bakom deras inledande. Här beskriver vi de akuta 4-aminopyridin kortikala beslag modeller etablerat mus och mänsklig vävnad.
Abstract
Kontrollera kramper är fortfarande en utmanande problem för läkarkåren. För att göra framsteg, måste forskarna utförligt studera beslag dynamics och undersöka dess underliggande mekanismer. Akut beslag modeller är bekväma, erbjuder möjligheten att utföra elektrofysiologiska inspelningar och kan generera en stor mängd electrographic beslag-liknande (ictal) händelser. De lovande resultaten från akut beslag modeller kan sedan vara avancerade till kronisk epilepsi modeller och kliniska prövningar. Således, studera anfall i akut modeller som troget efterbilda electrographic och dynamiska underskrifter av kliniska anfall kommer vara avgörande för att göra kliniskt relevanta fynd. Studera ictal händelser i akut beslag modeller beredd från mänsklig vävnad är också viktigt för att göra fynd som är kliniskt relevant. Viktiga fokuserar i denna uppsats på den kortikala 4-AP-modellen på grund av dess mångsidighet generera ictal händelser i både i vivo och in vitro- studier samt i både mus och mänsklig vävnad. Metoderna i denna uppsats kommer att också beskriva en alternativ metod för beslag induktion med noll-Mg2 + modell och ger en detaljerad översikt över fördelar och begränsningar av den epileptiform-liknande verksamhet i de olika akut beslag-modeller. Dessutom genom att utnyttja kommersiellt tillgängliga optogenetic mus stammar, kan en ljuspuls i korthet (30 ms) användas för att utlösa en ictal händelse som är identiska med dem som uppstår spontant. Likaså, 30-100 ms puffar av neurotransmittorer (Gamma-Amino smörsyra eller glutamat) kan tillämpas på den mänskliga vävnaden att utlösa ictal händelser som är identiska med dem som uppstår spontant. Förmågan att utlösa ictal evenemang på begäran i akut beslag modeller erbjuder nyfunna förmåga att iaktta det exakta händelseförloppet som ligger bakom beslag inledande dynamics och effektivt utvärdera potentiella anfallsskydd terapier.
Introduction
Akut beslag modeller kan framgångsrikt återskapa electrographic signaturer som påminner om ictal händelser observerades i elektroencefalogram (EEG) individer upplever ett beslag. Forskare använder dessa ictal-liknande händelser (hädanefter kallas ‘ictal evenemang’) som surrogat för beslag händelse1. Kliniskt, tjäna ictal händelser som en pålitlig proxy för beslag händelser eftersom anfall är en neurologisk sjukdom som härstammar från hjärnan. I epilepsi övervakningsenheten åberopa neurologer upptäckt av ictal händelser att bekräfta hjärnans epileptogena region och isolera det för resektion2. I intensivvårdsavdelning övervaka läkare ictal aktivitet för att bedöma om eventuella krampaktivitet kvarstår i sederad patienter3. Kontrollera kramper återstår att en utmanande fråga för det medicinska samfundet, eftersom 30% av epilepsipatienter är resistenta till tillgängliga medicinering4,5och 10% av medicinska ärenden som rör läkemedelsinducerad kramper inte svarar på standardbehandling3. Detta utgör ett allvarligt problem för samhället, som 10% av den amerikanska befolkningen är prospekterat för att uppleva en beslag händelse under sin livstid och 3% förväntas utveckla epilepsi6.
Studera anfall i kronisk epilepsi modeller är dyra, mödosam och ofta ta månader att förbereda7. Det är också svårt att utföra elektrofysiologiska inspelningar i fritt rörliga djur. Kliniska prövningar möta liknande problem, samt ytterligare komplikationer relaterade till patientens samtycke, variabilitet i deltagarnas bakgrunder och de moraliska och etiska överväganden inblandade8. Akut beslag modeller, däremot, är gynnsamma eftersom de är relativt bekvämt att förbereda, kostnadseffektiva och kan generera stora volymer av ictal händelser för studien9. Vävnaden är dessutom fast i ett stabilt läge, så förutsättningarna är idealisk för att utföra nödvändigt att studera beslag dynamics och relaterade underliggande patofysiologin elektrofysiologiska inspelningarna. Akut beslag modeller förblir gynnsamt över i silico (dator) modeller eftersom de är baserade på biologiskt material består av hjärnans konstituerande neuronala nätverk med alla dess inneboende faktorer och synaptic anslutning, som inte kan fångas av även de mest detaljerade dator modeller10. Dessa funktioner gör akut beslag modeller redo för att vara effektiv screening för potentiella anfallsskydd terapier och göra preliminära resultat innan dem för vidare utredning i kronisk epilepsi modeller och kliniska prövningar.
Typiskt, akut beslag modeller härleds från normal hjärnvävnad som har utsatts för hyper-hetsiga förhållanden. För att inducera kliniskt relevanta ictal händelser i frisk hjärnvävnad, är det viktigt att förstå att hjärnan fungerar optimalt i ett kritiskt tillstånd11 där excitation (E) och hämning (I) är balanserat12. En störning av E-jag balans kan leda till hyper-retbara beslag staten där fällningen ictal händelser. Inom denna konceptuella ram, det finns därför två viktiga strategier för att generera ictal händelser i hjärnan skivor (in vitro-) eller hela-hjärnan (i vivo) preparat: antingen minskad hämning (”avhämning”) eller ökade magnetisering (”icke-avhämning”). Dock ictal händelser sorteras högt och synkroniserade händelser som kräver påverkan av GABAergic interneuroner att orkestrera den neurala nätverk aktivitet13,14. Av denna anledning är icke-avhämning modeller de mest effektiva för generera ictal händelser i isolerade neurala nätverk, såsom i en in vitro- hjärnan skiva15, in vitro- avhämning modeller ofta leda till tillsatta aktivitet påminner om interictal-liknande tillsatta. Dessutom inom den tankeramen, kan en momentan Synkronisera händelse också tillförlitligt utlösa en ictal händelse16. I själva verket kan en ictal händelse utlösas av någon mindre störning som tillämpas på de neurala system17 när det är i ett kritiskt tillstånd övergången (”bifurkation”) punkt18. Traditionellt har förmåddes dessa störningar genom elektrisk stimulering. Den senaste utvecklingen av optogenetik i neurovetenskap, men erbjuder nu en mer elegant strategi för att inducera kritiskt tillstånd övergångar16.
De metoder som beskrivs i detta dokument visar hur du generera ictal evenemang på begäran i akut beslag modeller för både in vitro- (steg 1 i protokollet) och in-vivo studier (steg 2 i protokollet). De innebär valet av hjärnregionen, beslag induktion metod, studie typ och arter. dock kommer att inriktas på det rekommendera valet av en akut 4-AP kortikala beslag modell på grund av dess mångsidighet i en mängd olika studie typer. 4-AP beslag akut in vitro- modellen är baserad på standardprotokollet att förbereda högkvalitativa hjärnan skivor för elektrofysiologiska inspelningar och imaging studier19. Dessa protokoll har redan använts för att göra i vitro koronalt hjärnan skivor från somatosensoriska-motoriska cortex möss16,20 och människor21. Ändringar generera ictal händelser i dessa typer av hjärnan skivor har påvisats tidigare16 och fullständiga uppgifter beskrivs i protokollet nedan. Den akuta i vivo 4-AP kortikala beslag modellen bygger på standardprotokollet att förbereda en kraniotomi för imaging studier22. Ändringen är att ingen (glasskiva) fönster installeras efter kraniotomi. Prokonvulsiva agenter (4-AP) tillämpas i stället lokalt exponerade cortex att inducera ictal händelser medan djuret är under narkos. Till vår kunskap var vår grupp först med att utveckla denna akut i vivo kortikala beslag modell i möss16,23. Den akut i vivo 4-AP kortikala beslag modell beredd från vuxna möss har utvecklats för att komplettera den in vitro- slice modellen från juvenil vävnad. Replikering av fynden i den vuxna i vivo beslag modellen hjälper till att generalisera resultaten från segment modeller genom att adressera den inneboende oro avseende icke-fysiologiskt 2D hjärnan bitens (kontra en 3-D hela-hjärnan struktur) och de fysiologiska skillnaderna mellan juvenil och adult vävnad.
Metoden på begäran ictal händelse insättande demonstreras med en picospritzer eller optogenetic strategier antingen puffar av neurotransmittorer. Till bäst av vår kunskap är vår grupp först att inleda ictal händelser i mänsklig vävnad med hjälp av signalsubstanser via en picospritzer16. För optogenetic strategier är C57BL/6 möss stammen konventionella stammen används för att uttrycka transgener. Uttrycket av channelrhodopsin-2 (ChR2) i antingen GABAergic interneuroner eller glutamatergic pyramidala celler kommer att ge valfri förmågan att generera ictal händelser on-demand med korta ljuspulser. Lämplig optogenetic möss stammar inkludera den kommersiellt tillgängliga C57BL/6 variant som uttrycker ChR2 i antingen interneuroner, med hjälp av musen vesikulär GABA transportör promotor (VGAT)24, eller pyramidala celler, använder musen bräss cell antigenet 1 promotor (Thy1)25. Dessa kommersiellt tillgängliga VGAT-ChR2 och Thy1-ChR2 möss ger möjlighet att aktivera GABAergic nervceller eller glutamatergic nervceller, respektive i hjärnbarken med blå (470 nm) ljus. Förmågan att generera ictal händelser på efterfrågan i akut beslag modeller kan erbjuda nya möjligheter att studera beslag inledande dynamics och effektivt utvärdera potentiella anfallsskydd terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjärnan skivor behandlas med ett prokonvulsiva läkemedel eller en förändrad ACSF perfusatet att öka det neurala nätverket retbarhet och främja en utfällning av ictal händelser (electrographic beslag-liknande händelser). För möss, bör Rekommenderad koronalt skivor av området somatosensoriska-motor innehålla cingulum cortex, område 2 (CG), men inte det retrosplenial området (RS); dessa anatomiska markörer identifiera spänna av koronalt skivor som är bäst för att inducera ictal händelser. En valfri ä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den kanadensiska institut för hälsa forskning (MOP 119603 Peter L. Carlen och Taufik A. Valiante), Ontario hjärnan Institutet (att Taufik A. Valiante) och den Mightex studenten forskningsanslag (till Michael Chang). Vi vill tacka Liam Long för hans hjälp i filma video manuskriptet. Vi skulle vilja erkänna Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran och Shadini Dematagoda för deras hjälp i sammanställningen i siffror och tabeller i detta manuskript. Siffror 1A, 3A, 4Aoch 6A är alla ursprungliga siffror från Publiceringsnivåerna i Chang et al. 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
