חניכה הדור, על פי דרישה חריפה פעילות התקפי. מכרסם, רקמה אנושית
Summary
מודלים התקף אקוטי חשובים ללמוד המנגנונים אפילפטית אירועים. יתר על כן, היכולת להפיק אפילפטית אירועים לפי-דרישה מספק שיטה יעילה במיוחד ללמוד רצף האירועים שבבסיס בהכנסתם המדויק. כאן, אנו מתארים את הדגמים פרכוס קורטיקלית פמפרידין חריפה נוסדה בשנת רקמה אנושית של עכבר.
Abstract
שליטה התקפים נותר סוגיה מאתגרת עבור הקהילה הרפואית. כדי להפוך את התקדמות, חוקרים צריכים דרך בחקר דינמיקה פרכוס ולחקור בהרחבה מנגנונים הבסיסית שלה. התקף אקוטי דגמים נוחים, מציעים את היכולת לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, ניתן להפיק כמויות גדולות של electrographic פרכוס דמוי אירועים (התקפי). ממצאי מבטיח מודלים התקף אקוטי ניתן אז מתקדמים כדי אפילפסיה כרונית מודלים של ניסויים קליניים. לפיכך, לומד התקפים בדגמי חריפה להעתיק במדויק את חתימות electrographic, דינמיות של התקף קליניים יהיה חיוני לייצור ממצאים הרלוונטית קלינית. לומד אירועי התקפי. התקף אקוטי דגמים שהוכנו רקמה אנושית חשוב גם להכנת הממצאים הרלוונטיים קלינית. המוקד מפתח בעיתון הזה הוא על מודל 4-AP קורטיקלית בשל צדדיות שלה ביצירת אירועים התקפי. במחקרים גם ויוו וגם במבחנה , כמו גם העכבר וגם רקמה אנושית. השיטות בעיתון הזה גם מתארים שיטה חלופית האינדוקציה ההתקף באמצעות אפס-Mg2 + המודל ומספקים סקירה מפורטת על היתרונות והמגבלות של פעילות אפילפטית דמוי המופקים השונות חריפה מודלים התקף. יתר על כן, על ידי ניצול של optogenetic זמינים מסחרית העכבר זנים, דופק אור הבריף (30 ms) יכול לשמש כדי לעורר אירוע התקפי זהים לאלו המתרחשים באופן ספונטני. באופן דומה, פחזניות 30-100 ms של נוירוטרנסמיטרים (חומצה גאמא אמינו בוטירית או גלוטמט) ניתן להחיל הרקמה האנושית כדי לעורר התקפי. אירועים זהים לאלו המתרחשים באופן ספונטני. היכולת לעורר התקפי. אירועים לפי-דרישה במודלים התקף אקוטי מציע את היכולת החדשה כדי לבחון את רצף המדויק של אירועים ביסוד תפיסת החניכה dynamics ביעילות להעריך את פוטנציאל טיפולי אנטי-אפילפטית.
Introduction
מודלים התקף אקוטי יכול לשכפל בהצלחה מזכיר אירועים התקפי שנצפתה על העוויתיים (EEG) של אנשים חווים התקף electrographic חתימות. חוקרים משתמשים אלה אירועים דמויי התקפי (המכונה בזאת התקפי ‘אירועים’ ‘) כתחליף עבור אירוע פרכוס1. קלינית, אירועי התקפי. לשמש כמדד מהימן לאירועים פרכוס מאז ההתקפים הפרעה נוירולוגית שמקורה במוח. יחידת ניטור אפילפסיה, נוירולוגים להסתמך על הגילוי של אירועים התקפי. כדי לאשר את אזור epileptogenic של המוח ולבודד אותו עבור כריתה2. בנמרץ, רופאים לפקח על פעילות התקפי. כדי להעריך אם כל פעילות ההתקף נמשך חולים מסומם3. שליטה התקפים נותר נושא מאתגר עבור הקהילה הרפואית, כמו 30% מהחולים אפילפסיה עמידים סמים תרופות זמינות4,5, 10% במקרים רפואיים שיכרון התקפים של הם להגיב הטיפול הסטנדרטי3. זה מציג בעיה רצינית עבור החברה, 10% מהאוכלוסייה האמריקאית היא prospected לחוות אירוע פרכוס אחד ךלהמב, 3% צפויים לפתח אפילפסיה6.
לומד התקפים במודלים אפילפסיה כרוני הוא יקר, מייגעת, לעתים קרובות לקחת חודשים להתכונן7. . זה גם קשה לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במעבר בחופשיות חיות… ניסויים קליניים בבני להתמודד עם בעיות דומות, כמו גם מורכבויות נוספות הקשורות החולה והסכמתו, השתנות הרקעים של המשתתפים, מעורבים שיקולים מוסרי וערכי,8. מודלים התקף אקוטי, מצד שני, הם חיוביים כי הם יחסית נוח להכין חסכוניים, מסוגל לייצר כמויות גדולות של אירועי התקפי. המחקר9. בנוסף, הרקמה קבוע בעמדה יציבה, אז התנאים אידיאליים לביצוע ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות צריך להתעמק פרכוס dynamics, הפתופיזיולוגיה הקשורה הבסיסית. מודלים התקף אקוטי להישאר חיובית על מודלים סיליקו (מחשב) משום שהם מבוססים על החומר הביולוגי מורכב הרשת של המוח העצבית המרכיבים אותה עם כל הגורמים הטבועים קישוריות סינפטית, זה עשוי לא להילכד על-ידי מחשב אפילו הכי מפורט מודלים10. תכונות אלה להפוך התקף אקוטי מודלים צפוי להיות יעילים הקרנת עבור טיפולים אנטי-אפילפטית פוטנציאליים ולגרום ממצאים ראשוניים לפני קידום אותם לחקירה נוספת באפילפסיה כרונית מודלים של ניסויים קליניים.
בדרך כלל, התקף אקוטי מודלים נגזרות רקמת מוח נורמלי, זה כבר נתון לתנאים hyper-טמפרמנט. לזירוז הרלוונטית קלינית אירועי התקפי ברקמת המוח בריא, חשוב להבין כי המוח מתפקד בצורה אופטימלית המצב קריטי11 עירור (E) וניגוד (I) איפה מאוזנת12. הפרעה של ה-E-אני האיזון יכול להוביל המדינה תפיסה היפר-טמפרמנט שבה אירועי התקפי. לזרז. בהתאם לכך, במסגרת מושגית זו, קיימות שתי אסטרטגיות מרכזיות להפקת אירועים התקפי פרוסות המוח (במבחנה) או בכל ההכנות שלם-מוח (ב- vivo): ירד עיכוב (“עכבה של הקדמית”) או גדל עירור (“אי-עכבה של הקדמית”). עם זאת, אירועי התקפי מאוד מסודרות ומסונכרנות האירועים הדורשים את השפעת GABAergic interneurons שננהל את פעילות13,של רשת עצבית14. מסיבה זו, דגמים שאינם עכבה של הקדמית הן היעילות ביותר לאירועים התקפי. ביצירת ברשתות עצביות מבודד, כגון במבחנה המוח פורסים15, ואילו במבחנה עכבה של הקדמית מודלים נפוץ להוביל spiking פעילות המזכירה interictal דמוי עולה. יתר על כן, במסגרת מושגית זו אירוע המסנכרן רגעית ניתן בצורה אמינה גם מפעילים של אירוע התקפי.16. למעשה, אירוע התקפי. יכול להיות מופעלות על ידי כל ההפרעות קלות להחיל את המערכת העצבית17 כאשר זה נקודת מעבר (“נגע הסתעפות”) המצב קריטי18. באופן מסורתי, לפליטת אלה היו המושרה על ידי גירוי חשמלי. ההתפתחות האחרונה של optogenetics במדעי המוח, לעומת זאת, מציעה כעת אסטרטגיה יותר אלגנטי לזירוז המצב קריטי מעברים16.
בשיטות המתוארות במאמר זה מדגימים כיצד ליצור אירועים התקפי. לפי דרישה במודלים התקף אקוטי במבחנה (שלב 1 של פרוטוקול) וגם אין ויוו מחקרים (שלב 2 לפרוטוקול). הם כרוכים הבחירה של אזור במוח, פרכוס אינדוקציה שיטה, סוג המחקר המינים; עם זאת, המוקד יהיה על הבחירה המומלצת מודל חריפה 4-AP קורטיקלית התקף בגלל צדדיות שלה במגוון רחב של סוגי המחקר. דגם 4-AP התקף אקוטי במבחנה מבוססת על פרוטוקול רגיל להכין פרוסות המוח איכותיים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות ולומד הדמיה19. פרוטוקולים אלה כבר בשימוש כדי לגרום במבחנה המוח הילתית פרוסות קליפת המגע-מנוע של עכברים16,20 ובני21. שינויים כדי להפיק אירועים התקפי בסוגים אלה של פרוסות המוח הוכחו בעבר16 ואת הפרטים המלאים מתוארים את פרוטוקול להלן. המודל 4-AP קורטיקלית התקף אקוטי ויוו מבוססת על פרוטוקול רגיל להכין גולגולת עבור הדמיה מחקרים22. השינוי הוא כי ללא חלון (שקופיות זכוכית) מותקן בעקבות את הניתוח. במקום זאת, proconvulsant סוכנים (4-AP) הגארדיאן מוחלים על קליפת המוח החשוף לזירוז אירועי התקפי. בעוד החיה הוא בהרדמה כללית. לידע שלנו, הקבוצה שלנו היה הראשון לפתח חריפה ויוו פרכוס קורטיקלית מודל זה עכברים16,23. חריפה ויוו פרכוס קורטיקלית 4-AP המודל מקריסטלים של עכברים בוגרים פותחה כדי להשלים את המודל פרוסה במבחנה של רקמות לנוער. השכפול של הממצאים במודל פרכוס למבוגרים ויוו מסייעת להכליל ממצאי מודלים פרוסה באמצעות טיפול את החששות הכרוכים בדבר התנאים הלא-פיזיולוגיים של פרוסה המוח 2D (לעומת תלת-ממדי שלם-מוח מבנה) וההבדלים פיזיולוגי בין רקמות לנוער ומבוגרים.
השיטה של חניכה אירוע התקפי. לפי דרישה הוא הפגין באמצעות או פחזניות של נוירוטרנסמיטרים אסטרטגיות picospritzer או optogenetic. לפי מיטב ידיעתנו, הקבוצה שלנו הוא הראשון ליזום אירועים התקפי. רקמות אנושיות באמצעות נוירוטרנסמיטורים ויה picospritzer16. Optogenetic אסטרטגיות, המתח עכברים C57BL/6 הוא המתח קונבנציונאלי משמש ביטוי transgenes. הביטוי של channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic interneurons או glutamatergic תאים כפירמידה יספקו את היכולת אופציונלי להפיק אירועים התקפי. לפי-דרישה עם להבזקי האור קצרה. זני עכברים optogenetic מתאימים כוללים את הווריאציה C57BL/6 זמינים מסחרית המבטאת ChR2 ב משני interneurons, בעזרת העכבר vesicular גאבא טרנספורטר promotor (VGAT)24, או תאים כפירמידה, באמצעות העכבר התימוס תא אנטיגן 1 promotor (Thy1)25. אלו עכברים זמינים מסחרית של VGAT-ChR2 ו- Thy1-ChR2 מציעים את ההזדמנות כדי להפעיל הנוירונים GABAergic או glutamatergic הנוירונים, בהתאמה, בתוך קליפת עם כחול (470 ננומטר) אור. היכולת להפיק אירועים התקפי. לפי דרישה במודלים התקף אקוטי יכול להציע הזדמנויות חדשניים בחקר תפיסת החניכה דינמיקה ולהעריך ביעילות טיפולים אנטי-אפילפטית פוטנציאליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוסות המוח מטופלים עם תרופה proconvulsant או perfusate חנה המבר שינו כדי להגביר את רגישות של הרשת העצבית ולקדם משקעים של התקפי. אירועים (אירועים פרכוס דמוי electrographic). על עכברים, להכיל הפרוסות הילתית המועדפת של אזור המגע-מנוע בקליפת cingulate, אזור 2 (ג), אבל לא את אזור retrosplenial (RS); סמנים אנטומיים אלה מסייעים ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות הקנדי של המחקר בריאות (מגב 119603 פיטר ל’ Carlen, תאופיק א Valiante), מכון המוח אונטריו (כדי תאופיק א Valiante), את Mightex תלמיד המחקר מענק (מייקל צ’אנג). ברצוננו להודות ליאם לונג על עזרתו לצלם וידאו כתב היד. ברצוננו להודות פאריה Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran, Shadini Dematagoda לסיוע שלהם בשנת קומפילציה לאיורים ולטבלאות בכתב היד. דמויות 1A, 3A, 4Aו- 6A הם דמויות המקורי כל זני הנתונים פורסמו ב- Chang. et al. 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
