齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始
Summary
急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性 4-アミノピリジン皮質発作モデルについて述べる。
Abstract
医療界の挑戦的な問題のまま発作を制御します。進歩をするためには、研究者は広く研究して発作とその基になるメカニズムを調査する方法必要があります。急性発作モデル便利、電気生理学的記録を実行する能力を提供して、アノキシア発作様 (発作時) イベントの大規模な量を生成することができます。急性発作モデルの有望な結果は慢性てんかんモデルや臨床試験にして高度なことができます。したがって、臨床発作のエレクトロ グラフと動的署名を忠実に再現するモデルが急性の発作を勉強して、ある臨床的に関連性の高い結果を作るために不可欠。急性発作モデル人間のティッシュから準備で発作時のイベントを勉強しても、臨床的に関連する所見を作るため重要です。本稿の重要な焦点は、体内と体外の研究だけでなく、マウスやヒトの組織で発作時のイベントの生成の多様性のための皮質 4 AP モデルです。本稿のメソッドも 0 Mg2 +モデルを用いた発作誘導の代替方法について説明し、利点の詳細な概要と別の生成されたてんかんのような活動の制限を提供する急性発作モデル。また、マウス系統に市販の光を利用して短い (30 ms) の光パルスが自発的に発生しているものと同じ発作時イベントをトリガーする使用できます。同様に、神経伝達物質 (γ-アミノ酪酸、グルタミン酸) の 30-100 ms パフは、自発的に発生しているものと同じです発作時のイベントをトリガーする人体の組織に適用できます。急性発作モデルでオンデマンドに発作時のイベントをトリガーする機能は、発作開始ダイナミクスの根底にある、潜在的な抗けいれん療法を効率的に評価するイベントの正確なシーケンスを観察する新たな能力を提供しています。
Introduction
急性発作モデルは正常に発作を経験する人の脳波 (EEG) にみられる発作時のイベントを連想させるエレクトロ グラフ署名を再現できます。研究者は、代理として奪取イベント1(ここの発作時のイベント’ と呼ばれる) これらの発作のようなイベントを使用します。臨床的に発作時のイベントは、以来、発作が脳から発する神経疾患発作イベントの信頼性の高いプロキシとして機能します。てんかんモニタリング ユニット、神経科医はてんかんの脳の領域を確認し、切除2に分離する発作時イベントの検出に依存します。集中治療室では、医師はどんな発作活動が鎮静患者3に固執する場合を評価する発作時のアクティビティを監視します。てんかん患者の 30% は使用可能な薬4、5、薬剤耐性と薬剤誘発性発作を含む医学の場合の 10% が医療界の挑戦的な問題であることのまま発作を制御します。3標準治療に応答しません。これはアメリカの人口の 10% は彼らの一生の間に 1 つの発作イベントを体験する見込し、3% のてんかん6の発展が予想される社会にとって深刻な懸念を提示します。
発作慢性てんかんモデルでの勉強は、高価な骨の折れるとしばしば7の準備に数ヶ月をかかります。また、動物を自由に移動で電気生理学的記録を行うことは困難です。ひと臨床試験患者の同意、参加者の背景や道徳的、倫理的な考慮事項関連する8の変動に関連する追加の複雑さと同様、同様の問題に直面します。その一方で、急性発作モデル比較的準備に便利、低コスト、大量の研究9発作時のイベントを生成できる、有利です。さらに、条件が電気生理学的記録発作ダイナミクスと関連の基本的な病態を検討する必要を実行するために理想的なので、組織は安定した位置に固定されます。彼らは、脳のすべての固有の要因と取り込めないことがあるシナプスの接続構成ニューロン ネットワークの構成生物学的材料に基づいているため急性発作モデルはインシリコ(コンピューター) モデル上良好のまま最も詳細なコンピューターによって10をモデル化します。これらの機能は、急性発作モデルの潜在的な抗けいれん治療スクリーニングと慢性てんかんモデルと臨床試験のさらなる調査のためにそれらを進める前に予備調査結果を作るで効率的に構えを作る。
通常、急性発作モデルはハイパー興奮性の条件にさらされている正常な脳組織から派生しました。健康的な脳組織の臨床的に関連する発作時イベントを誘発するには、それは、励起 (E) と (I) 抑制がバランスの取れた12脳が重大な状態11で最適に機能するかを理解することが重要。E の混乱-私のバランスは発作時イベントが沈殿させるハイパー興奮性発作状態につながることができます。したがって、この概念の枠組みの中で、脳のスライス (生体外で) または全体の脳 (体内) 準備発作時のイベントを生成する 2 つの主要な方法があります: 抑制 (“disinhibition”) を減少または増加励起 (“非-disinhibition”)。しかし、発作時のイベントは高い並べられニューラル ネットワーク活動13,14を統制する gaba 作動性介在ニューロンの影響を必要とするイベントを同期します。このため、非脱モデルは、分離のニューラル ネットワークにおける発作時イベントの生成の最も効果的な培養脳スライス15、脱モデル体外一般的に活動をスパイクにつながるに対し、します。発作間欠期のようなスパイクを連想させる。さらに、この概念の枠組みの中で、瞬間的な同期イベントは、確実に発作イベント16をトリガーできます。実際には、発作時のイベントは、重大な状態遷移 (「分岐」) ポイント18時に神経系の17に適用される任意のマイナーな摂動によって引き起こされることができます。伝統的に、これらの摂動は、電気刺激により誘導された.神経科学における光遺伝学の最近の発展しかし、今重大な状態遷移16を誘導するためにより洗練された戦略を提供しています。
このペーパーで説明する方法体外(プロトコルの手順 1) と生体内での研究 (プロトコルの手順 2) の両方のための急性発作モデルでオンデマンドで発作時のイベントを生成する方法を示します。彼らは脳の領域、発作誘導法、研究の種類、および種の選択を含むただし、フォーカスは、さまざまな種類の研究の多様性のため急性 4 AP 皮質発作モデルの推奨される選択になります。4 AP 発作モデル急性体外は電気生理学的記録の質の高い脳スライスを準備する標準プロトコルに基づいており、イメージング研究19。これらのプロトコルは、マウス16,20と人間21の体性感覚運動皮質からコロナ脳スライスを体外に既に使用されています。脳スライスのこれらのタイプの発作時のイベントを生成する変更は以前16と完全な詳細についてはプロトコルの下、実証されています。4 AP 皮質発作モデル急性生体内では、イメージング研究22のために開頭術を準備する標準のプロトコルに基づいています。変更は、(スライド ガラス) ウィンドウがインストールされていないこと、開頭手術の後です。代わりに、proconvulsant エージェント (4 AP) は、動物は、全身麻酔下では発作時のイベントを誘発する露出の皮質に局所的に適用されます。私たちの知る限り、私たちのグループは最初のモデルを開発するこの急性体内皮質発作マウス16,23だった大人のマウスから作製した急性体内4 AP 皮質発作のモデルは、少年組織から培養スライス モデルを補完するために開発されました。2 D 脳スライス (対3-D 全体の脳の非生理的条件に関する固有の懸念に取り組むことによってスライス モデルからの調査結果を一般化するのに役立ちます発作モデル アダルト生体内における所見のレプリケーション構造) および年少および大人のティッシュの生理の違い。
Picospritzer または光遺伝学的戦略と神経伝達物質のいずれかのパフを使用してオンデマンドで発作時イベント開始の方法を示します。我々 の知る限り、私たちのグループは神経伝達物質を介してpicospritzer16を使用して人間の組織で発作時のイベントを開始する最初の。C57BL/6 マウス株は、光遺伝学的戦略、遺伝子を表現するために使用される従来のひずみです。チャネルロドプシン 2 (ChR2) を gaba 作動性介在ニューロンのグルタミン酸作動性の錐体細胞の発現は、短い光パルスを用いたオンデマンドに発作時のイベントを生成するオプションの機能を提供します。適切な光マウス系統にはマウス水疱性 GABA トランスポーター プロモーター (vgat ノックアウト)24、またはマウス胸腺細胞抗原 1 を使用して、ピラミッド型のセルを使用して、いずれかの介在ニューロンに ChR2 を表現する市販の C57BL/6 バリアントが含まれますプロモーター (Thy1)25。これらの市販 vgat ノックアウト ChR2 Thy1 ChR2 マウスは、それぞれ、青と大脳新皮質のグルタミン酸作動性ニューロン、gaba 作動性ニューロンまたはアクティブにする機会を提供 (470 nm) の光。急性発作モデルのオンデマンド発作時のイベントを生成する能力は発作開始ダイナミクスし、潜在的な抗けいれん療法を効率的に評価する新しい機会を提供できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳スライスは proconvulsant 薬やニューラル ネットワークの興奮性を高め、発作時イベント (アノキシア発作様イベント) の沈殿物を促進するために変更されたアプライド出納と扱われます。マウスの体性感覚-運動部最寄のコロナ スライス後板状領域 (RS) のではなく、エリア 2 (CG)、帯状皮質を含める必要があります。これらの解剖学的マーカーは、辺縁系発作時イベントの誘導に最適な各種の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、カナダ保健研究機関 (ピーター ・ l ・ カーレン、タウフィック A. Valiante モップ 119603)、(にする A. Valiante)、オンタリオの脳研究所と (マイケル ・ チャン) に Mightex 学生研究助成金によって支持されました。リアム長いビデオの原稿を撮影の彼の援助に感謝したいと思います。数字とこの原稿内のテーブルをコンパイルのパリア Baharikhoob、Abeeshan Selvabaskaran、Shadini Dematagoda を認識したいと思います。図 1 a、 3 a 4 a 6 aチャンらに公開されているデータから作られたすべての元の数字16。
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
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