Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur DNA-Protein Interaktionen durch Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) mit ein ortspezifisch modifizierte λ-DNA-Substrat und einem Quantenpunkt beschriftet Protein zu studieren.
Abstract
Die Fluoreszenz-Mikroskopie hat große Beiträge geleistet, in die Mechanismen der komplexe biologische Prozesse auf der Ebene des einzelnen Moleküls sezieren. In Einzelmolekül-Assays für die DNA-Protein Interaktionen zu studieren, gibt es zwei wichtige Faktoren für die Prüfung: die DNA-Substrat mit genügend Länge für einfache Beobachtung und Kennzeichnung ein Protein mit einer geeigneten fluoreszierende Sonde. 48,5 kb λ-DNA ist ein guter Kandidat für die DNA-Substrat. Quantenpunkte (Qdots), können als eine Klasse von fluoreszierenden Sonden, langjähriger Beobachtung (Minuten bis Stunden) und qualitativ hochwertige Bilderfassung. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll, um DNA-Protein Interaktionen Ebene der Einzelmolekül-Studie umfasst eine ortspezifisch modifizierte λ DNA Vorbereitung und Kennzeichnung ein Zielprotein mit Streptavidin-beschichteten Qdots. Für ein Proof of Concept wir wählen Sie ORC (Herkunft Erkennung komplexer) in angehende Hefe als ein Protein des Interesses und seiner Interaktion mit einer ARS (autonom replizierende Sequenz) mit TIRFM zu visualisieren. Im Vergleich mit anderen fluoreszierenden Sonden, Qdots haben offensichtliche Vorteile in Einzelmolekül-Studien aufgrund seiner hohen Stabilität gegen Immunofluoreszenz, aber es sei darauf hingewiesen, dass diese Eigenschaft die Anwendung in der quantitativen Assays schränkt.
Introduction
Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA sind entscheidend für viele komplexe biologische Prozesse, wie DNA-Replikation, DNA-Reparatur und Transkription. Obwohl konventionelle Ansätze die Eigenschaften dieser Prozesse beleuchten haben, sind viele wichtige Mechanismen noch unklar. Vor kurzem, wurden einige der Mechanismen, mit den sich rasch entwickelnden Einzelmolekül-Techniken, adressierte1,2,3.
Die Anwendung der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie auf DNA-Protein Interaktionen in Echtzeit vor allem Visualisierung hängt von der Entwicklung der Fluoreszenz-Detektion und fluoreszierende Sonden. Für ein einzelnes Molekül-Studie ist es wichtig, mit einer geeigneten fluoreszierende Sonde Proteins des Interesses zu kennzeichnen, da Fluoreszenz-Detection-Systeme meist im Handel erhältlich sind.
Fluoreszierende Proteine werden häufig in der Molekularbiologie verwendet. Jedoch beschränken die niedrige fluoreszierende Helligkeit und Stabilität gegen Immunofluoreszenz ihre Anwendung in vielen Einzelmolekül-Assays. Quantenpunkte (Qdots) sind winzige Leuchtdioden Nanopartikel4. Aufgrund ihrer einzigartigen optischen Eigenschaften Qdots sind 10 - 20 mal heller und mehrere tausend Mal stabiler als die verbreitete organische Farbstoffe5. Darüber hinaus haben Qdots eine große Stokes Shift (die Differenz zwischen der Position der Anregung und Emission Gipfel)5. So kann Qdots verwendet werden, für langjährige Beobachtung (Minuten bis Stunden) und Aufnahme von Bildern mit hohen Signal-Rausch-Verhältnis, während sie in der quantitativen Assays verwendet werden können.
Bisher gibt es zwei Ansätze, ein Zielprotein mit Qdots ortspezifisch zu kennzeichnen: Kennzeichnung mit Hilfe von Qdot konjugiert primäre oder sekundäre Antikörper6,7,8; oder das Zielprotein mit Qdots direkt, die basiert auf der starken Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin9,10,11,12,13Kennzeichnung. Streptavidin-beschichteten Qdots sind im Handel erhältlich. In unserer aktuellen Studie ortspezifisch biotinylierte Proteine in der angehenden Hefe mit hohem Wirkungsgrad durch co-Überexpression von BirA und Avi-markierten Proteinen gereinigt wurden in Vivo10. Durch die folgenden und Optimierung der Einzelmolekül-Assays14,15,16,17beobachteten wir die Wechselwirkungen zwischen Qdot-markierten Proteinen und DNA Einzelmolekül Ebene mit TIRFM10.
Hier wählen wir die angehenden Hefe Herkunft Anerkennung Komplex (ORC), die spezifisch erkennen und Binden an die autonom replizierende Sequenz (ARS), als unser Protein des Interesses. Das folgende Protokoll stellt eine schrittweise Anleitung zur Visualisierung der Interaktion des Qdot-Label ORKS mit ARS mit TIRFM. Die Herstellung der ortspezifisch modifizierte DNA Substrat, die DNA-biotinylierungen, Deckglas Reinigung und Funktionalisierung, Durchflusszelle Versammlung und der Einzelmolekül-Bildgebung sind beschrieben.
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Protocol
1. Vorbereitung des λ-ARS317 DNA-Substrat
- DNA-Substrat Bau und Verpackung
- Native λ-DNA mit Hilfe Xhoverdauen ich Enzym; verstärken 543 bp DNA Fragment Lager ARS317 aus genomischer DNA des angehenden Hefe mit Primer mit 20 bp homologe Sequenzen von vorgelagerten und nachgelagerten Xhoich Enzym Website auf Lambda DNA. Addieren Sie 100 ng der Xhoich verdaut λ-DNA und 10 ng DNA-fragment, zu 10 µL der homologen Rekombination Reaktionssystem, und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
- Um die Rekombination λ-DNA Verpacken, 25 µL der Lambda-Verpackung-Extrakte in der Rekombination Produkt hinzufügen, und die Reaktion bei 30 ° C für 90 min inkubieren. Fügen Sie eine zusätzliche 25 µL der Lambda-Verpackung-Extrakte in das Reaktionsgefäß. Weiterhin die Reaktion bei 30 ° C für 90 min inkubieren.
- 500 µL steriler Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) in das Reaktionssystem einfügen und durch Drehen der Röhre Kopf mehrmals vorsichtig mischen. Hinzufügen von 25 µL Chloroform, vorsichtig mischen und Lagerung bei 4 ° C.
- 100 µL der verpackten Phagen und 100 µL der Bakterien LE392MP hinzufügen (kultiviert auf 0,8 - 1,0 mit LB-Medium mit 10 mM MgSO4hinzufügen) in einen neuen Schlauch. 15 Minuten bei 37 ° C inkubieren.
- Fügen Sie 200 µL des Phagen-Bakterie Mischung in 4 mL Oftop Agar (LB-Medium + 0,7 % Agar + 10 mM MgSO4, gekühlt bis 48 ° C). Sofort durch Drehen der Röhre Kopf mehrmals mischen und auf einer vorgewärmten (37 ° C) LB-Platte Gießen.
- Über Nacht die Platte bei 37 ° C inkubieren und Bildschirm der λ-ARS317 Plaque mittels PCR und Sequenzierung.
- DNA-Substrat Reinigung von flüssigen Lysates11,18
- Wählen Sie eine Plakette in 200 µL steriler DdH2O mit 10 mM MgCl2 und 10 nM CaCl2. Mix mit 200 µL des Bakteriums LE392MP (kultivierten Übernachtung in LB-Medium), und bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
- Fügen Sie die Phagen-Bakterium-Mischung in 100 mL NZCYM (10 g/L NZ-Amin, 5 g/L Hefe-Extrakt, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino Hydrolysat und 2 g/L MgSO4·7H2O) Medium und Kultur für 7 h bei 37 ° C. Fügen Sie 250 µL Chloroform in die Kultur und für weitere 10 Minuten schütteln.
- Übertragen Sie die Kultur in eine 200 mL Flasche. Fügen Sie 5,8 g NaCl (1 M Endkonzentration hinzu), umrühren Sie, von hand lösen und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Sammeln des Überstands in ein 200 mL-Flasche und fügen Sie 10 % PEG8000 (m/V). Rühren Sie auflösen durch magnetische rühren Apparat und inkubieren Sie auf Eis für 30 Minuten oder länger.
- Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die Bakteriophagen auszufällen. Den überstand zu entfernen.
- Den Niederschlag in 2 mL Phagen Verdünnungspuffer aufzuwirbeln. In einem 15 mL-Tube übertragen Sie und 10 µL RNase (Endkonzentration ist 20 µg/mL) und 40 µL DNase (Endkonzentration ist 5 µg/mL). Bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
- Fügen Sie 2 mL 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25 % SDS, 15 µL Proteinase K (Endkonzentration ist 10 µg/mL). Bei 65 ° C für 10 min inkubieren.
- Fügen Sie 2 mL vorgekühlte Kalium Acetat (3 M, pH 4,8) und inkubieren Sie den Schlauch für 10 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 10 min bei 4 ° C, die unlöslichen Materialien zu entfernen.
- Fügen Sie 0,7 X Volumen von Isopropanol in der Überstand. Durch Drehen des Rohres Kopf mehrmals mischen und 2 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 10 min bei RT, DNA auszufällen. Den überstand zu entfernen.
- Waschen Sie die DNA, einmal mit 70 % Ethanol durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min. Überstands entfernen.
- Eluieren der DNS mit 500 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0) sanft, und übertragen Sie die DNA in 1,5 mL-Tube.
- Extrahieren Sie die DNA zweimal mit Phenol: Chloroform durch Zentrifugation bei 8.000 g für 10 Minuten.
- Niederschlag mit 0,7 X Volumen Isopropanol. Durch Drehen der Tube auf den Kopf sanft nach unten und bei 8.000 x g für 10 min zentrifugieren mischen.
- Einmal waschen mit 70 % Ethanol, in 200 µL TE aufzuwirbeln. Die DNA-Konzentration zu messen und bei-20 ° C in 12,5 µg Aliquote speichern.
2. λ-ARS317 DNA-Biotinylierungen
- Zu phosphorylieren biotinylierte Oligonukleotide (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3 ") ergänzen das linke Ende der Native λ DNA, hinzufügen 1 µL (100 µM) von Oligonukleotiden, 7,5 µL DdH2O, 1 µL 10-fach Ligase Puffer und 0,5 µL T4 PNK. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 3 h.
- Zu phosphorylieren λ-ARS317, fügen Sie 12,5 µg des λ-ARS317, 3 µL 10-fach Ligase Puffer, 1 µL T4 PNK und DdH2O Gesamtvolumen von 30 µL. brüten die Reaktion bei 37 ° C für 3 h.
- Um Oligonukleotide mit λ-ARS317 glühen, fügen Sie 0,5 µL phosphorylierten Oligonukleotide, 195 µL DdH2O, 25 µL 10 × Ligase Puffer in der phosphorylierten λ-ARS317 Rohr. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Rohr auf den Kopf drehen und inkubieren Sie bei 65 ° C für 5 min. Drehen Sie den Block Heizung und lassen Sie die Probe auf Abkühlen unter 33 ° C im Block.
- Um Oligonukleotide mit λ-ARS317 verbinden, fügen Sie 1 µL T4 DNA-Ligase und 0,63 µL von ATP (200 mM). Durch das Rohr auf den Kopf drehen vorsichtig mischen und über Nacht bei Raumtemperatur für 2 h oder 4 ° C inkubieren. Lagerung bei 4 ° C für 1 Monat.
Hinweis: Um zu vermeiden, die DNA aufbrechen, sollten die Rührschüssel Schritte erfolgen durch sanft das Rohr auf den Kopf drehen, statt der Vermischung mit Pipetten.
3. Deckglas Reinigung und Funktionalisierung
- Deckglas Reinigung
- Platz 20 Deckgläsern in 4 färbeküvetten (5 Deckgläsern/Jar), für 30 Minuten in Ethanol beschallen und Deckgläsern mit hochreinen H2O 3 Mal spülen.
- Für 30 Minuten mit 1 M Kalilauge (KOH) Beschallen Sie, und spülen Sie die Deckgläsern mit hochreinen H2O 3 Mal. Wiederholen Sie Ethanol und KOH Beschallung einmal.
- Beschallen Sie mit Aceton für 30 Minuten und dann gründlich mit hochreinen H2O (mindestens 3 mal).
Hinweis: Aceton muss entfernt werden gründlich durch das ausspülen mit hochreinen H2O, weil es eine Explosion verursachen, wenn organische Lösungsmittel (wie Aceton) fälschlicherweise mit der Piranha-Lösung gemischt14. - Legen Sie die Deckgläsern in Piranha-Lösung (3:1-Mischung aus H2SO4 und 30 % H2O2) und inkubieren Sie bei 95 ° C für 1 h.
Hinweis: Piranha Lösung ist sehr energisch und erosive, also mit Vorsicht verwenden. Beim Piranha Lösung vorbereiten, 50 mL von H2O2 zuerst in einen 500-mL-Becherglas hinzufügen, und fügen Sie dann 150 mL H2SO4 langsam in das Becherglas. - Spülen Sie die Deckgläsern mit hochreinen H2O 5 Mal. Dann waschen Sie jede Deckglas mit hochreinen H2O 3 Becher gefüllt mit hochreinen H2O gründlich mit und trocknen Sie das Deckglas mit Papier vom Rand des Deckglases. Das Deckglas in der Färbung Glas legen und das Deckglas gründlich in einem 110 ° C Ofen für 30 Minuten trocknen.
- Spülen Sie das Deckglas mit Methanol und legen Sie die Färbung Glas in den 110 ° C Backofen wieder auf das Deckglas gründlich trocknen.
Hinweis: Das Deckglas gründlich trocknen ist sehr wichtig, weil APTES haben viele möglichen Oberflächenstrukturen, sobald es in Gegenwart von Wasser19ist.
- Spülen Sie das Deckglas mit Methanol und legen Sie die Färbung Glas in den 110 ° C Backofen wieder auf das Deckglas gründlich trocknen.
- Deckglas Funktionalisierung
- 70 mL Silan-Lösung hinzufügen (93 % Methanol, 5 % Essigsäure und 2 % APTES) in jedes Glas, Schrauben Sie die Kappe und lassen das Glas bei Raumtemperatur über Nacht.
- Waschen und Trocknen der Deckgläsern, wie unter Schritt 3.1.5, außer die Deckgläsern gründlich mit Stickstoffgas anstatt sie im Ofen trocknen.
- 150 mg mPEG (Methoxy Polyethylenglykol) und 6 mg Biotin-PEG (Biotin-Polyethylenglykol) in 1 mL der 0,1 M frisch gekochten Nahco33 (pH 8,2) gründlich auflösen. Dann Zentrifuge mit 17, 000 X g für 1 min um unlösliche Stöpsel entfernen.
Hinweis: Frisch zubereitete Nahco33 ist fertig. Es gibt keine Notwendigkeit, den pH-Wert zu justieren. - Die silanisiert Deckgläsern in Boxen, legen Sie und zwei kleine Deckgläsern oben auf beiden Enden des silanisiert Deckgläsern. Pipette 100 µL der PEG-Lösung in der Mitte des silanisiert Deckglas, und oben ein weiteres silanisiert deckgläschen auflegen.
- Fügen Sie einige ultrapure H2O im Feld um es feucht zu halten und inkubieren Sie Deckgläsern mit PEG-Lösung für mindestens 3 Stunden im Dunkeln. Eine Inkubation über Nacht kann so gut funktionieren.
- Trennen Sie Deckglas Paare halten Sie die funktionalisierten Oberflächen Gesicht mit, spülen Sie die Deckgläsern mit hochreinen H2O ausführlich und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas.
- Markieren Sie die funktionalisierten Seite von Deckgläsern auf eine der Ecken mit einem Filzstift, halten die funktionalisierten Seite aufgedeckt, legen Sie sie in Kisten und speichern die Felder im Vakuum Exsikkator für 1 Monat.
- Um den Deckgläsern für eine längere Zeit zu speichern, legen Sie ein Deckglas in ein 50 mL-Tube gebohrt mit einem Loch auf seine Kappe, dann habe das Rohr in eine Plastiktüte und verschließen der Tasche mit einem Vakuumiergerät. Auf diese Weise können die Deckgläsern bei-20 ° C ca. 3 Monate gespeichert werden.
(4) Zelle Fließmontage
- Schneiden Sie einen 15 mm × 2 mm Kanal in der Mitte ein Stück doppelseitiges Klebeband (30 mm × 12 mm) mit einem Puncher.
- Die Papierseite des doppelseitigen Klebebandes ziehen Sie ab und fügen Sie ihn auf dem Objektträger mit zwei Löchern. Drücken Sie, um Luftblasen zu entfernen. Basierend auf unserer Erfahrung, ist es einfacher, die Luftblasen zu entfernen, durch die Papierseite als die Kunststoffteile auf der Seite des doppelseitigen Klebebandes abziehen.
- Schneiden Sie ein funktionalisierten Deckglas (60 mm × 24 mm) in vier Stücke (30 mm × 12 mm) mit einem Glas diamantbestückte scribe, und entfernen Sie den Schmutz mit Stickstoffgas. Beachten Sie, dass die funktionalisierten Seite nach oben.
- Die Kunststoffteile auf der Seite des doppelseitigen Klebebandes ziehen Sie ab, und fügen Sie die Folie auf die funktionalisierten Deckglas. Drücken Sie sanft, um Luftblasen zwischen dem Deckglas und das Band zu entfernen. Entfernen von Luftblasen gründlich Schütze die Durchflusszelle Austritt während Puffer gepumpt wurden.
- Legen Sie Einlass und Auslass-Schlauch bzw. in kleine und große Löcher. Befestigen Sie den Schlauch mit Epoxy.
- 20 µL Streptavidin (0,2 mg/mL) in die Messzelle mit einer Spritze manuell Pumpen und 10 min bei RT inkubieren. Dann Pumpen Sie blockierende Puffer10 in Durchflusszelle Streptavidin ersetzen, und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
5. Einzelmolekül-Visualisierung
- Erhalten Sie die fokale Ausrichtung der rot-dunkelrote mit A5 auf der Fluoreszenz-Mikroskop Test Folie #1 durch gleichzeitige Erregung mit 532 nm Laser und 640 nm Laser. Dual Wellenlänge Bilder mit Aufteilung der Optik (siehe Tabelle der Materialien) zu produzieren.
- Das Mikroskop setzen Sie die Durchflusszelle auf und schließen Sie ihre Auslass-Schlauch an eine längere Schläuche anschließen mit einer 10 mL-Feder auf einer automatischen Aufguss/Rücktritt programmierbaren Pumpe installiert.
Hinweis: Pumpen Puffer in der Messzelle unter bedeutet Rückzug Puffer aus den Zulauf-Schlauch der Durchflusszelle an der Spritze erwähnt. - Pumpen Sie blockierende Puffer mit 500 µL/min in der Durchflusszelle Luft schnell entfernen und sicherstellen, dass der Puffer in der Messzelle entsperrt ist. Dann Pumpen des blockierenden Puffers mit 200 µL/min in der Messzelle und drehen Sie den Ausgang Schlauch um Luftblasen aus den Zulauf-Schlauch und die Durchflusszelle gründlich zu entfernen.
Hinweis: Alle Puffer in der Messzelle gepumpt sollte für mindestens 15 Minuten vor dem Gebrauch in einem Vakuum Exsikkator entgast werden. - Fügen Sie 0,5 µL biotinylierte λ-ARS317 DNA in 80 µL blocking-Puffer, und in der Messzelle mit 25 µL/min 2 min Pumpen. Λ-ARS317 DNA mit 200 µL blocking-Puffer mit einer Rate von 50 µL/min, dann bündig.
- Pump 200 µL Puffer10 zu binden, mit einer Rate von 50 µL/min, den blocking-Puffer in der Messzelle zu entfernen.
- Hinzufügen von 0,2 µL Streptavidin beschichteten Qdot705 (1 µM) und 0,2 µL biotinylierte ORC (1,2 µM) in ein Gefäß und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Dann fügen Sie 20 µL Puffer in das Rohr zu binden, und legen Sie ihn auf Eis. Die Endkonzentration von ORC-Qdot705 ist etwa 10 nM.
- Fügen Sie 2 µL der ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL von DVB-t (100 mM), 1 µL von ATP (200 mM) in 96 µL Bindung Puffer. Die Endkonzentration von ORC-Qdot705 ist 0,2 nM.
- Pumpen Sie 20 µL 0,2 nM ORC-Qdot705 mit einer Rate von 10 µL/min in der Messzelle. Der übermäßige ORC-Qdot705 mit 200 µL Puffer Bindung mit einer Rate von 100 µL/min spülen. Dann Pumpen Sie Bindung Puffer mit 30 nM SYTOX Orange in der Messzelle, DNA-Substrate mit einer Rate von 100 µL/min zu beflecken.
- Das ORC-Qdot-705 -Signal begeistern und SYTOX Orange gefärbten DNA-Signal mit einem 405 nm-Laser und 532 nm Laser, beziehungsweise. Beobachten Sie die Signale gleichzeitig mit 100 µL/min-Fluss mit einem Quad-Band-Bandpass-Filter (FF01-446/510/581/703-25) und zeichnen Sie die Bilder vom EM-CCD mit 100 ms pro Frame. Sammeln Sie 20 Bild-Stacks aus verschiedenen Bereichen.
(6) Datenanalyse
- Zuschneiden der Bilder mit dem Fidschi-Software mit einer neuen Plugin, welches von uns geändert wird auf der Image-Plugin (OI_cut_RGBmerge basiert) von Dr. Ron Vale Lab an der University of California, San Francisco entwickelt.
- Schneiden Sie einen Stapel von Bildern (512 × 512 Pixel) in zwei Stapel von Bildern (256 × 256 Pixel). Einer ist ein 532 nm laser-spannendes Ergebnis, und das andere ist ein 405 nm laser-spannenden Ergebnis.
- Verarbeiten Sie 61 aufeinander folgenden Bildern mit Fidschi-Bild-Stapel-Z-Projekt (mittlere Intensität).
- Messen Sie die Länge der DNA (LDNA) und der Abstand von der Website des ORC-Qdot705 (LORC) Bindung an DNA an der DNS angebunden Ende manuell.
- Berechnet das Ergebnis LORC/lDNA mit excel, analysieren Sie die Daten mithilfe der bootstrap-Methode von R, dann das Histogramm zu erstellen und Gaußsche Verteilungen zu passen.
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Representative Results
Um die Interaktion zwischen ORC Qdot beschriftet und die ARS zu visualisieren, errichteten wir zuerst das λ-ARS317 DNA-Substrat. Ein DNA-Fragment mit ARS317 wurde integriert in XhoI Seite (33,5 kb) der native λ-DNA durch homologe Rekombination (Abbildung 1A). Die Rekombination Produkt wurde verpackt mit Extrakten und die verpackten Phagen Partikel auf LB-Platten (Abbildung 1 b) kultiviert wurden. Die positive Phagen-Plaque wurde mittels PCR überprüft und bestätigt durch Sequenzierung (Abbildung 1). Λ-ARS317 DNA wurde gereinigt von der flüssigen Lysaten (Abbildung 1).
Einzelmolekül-bildgebende Untersuchungen erfolgten am Ziel-Typ TIRFM Setup (Abbildung 2). Durch Kennzeichnung der biotinylierte Ork mit einem molaren Verhältnis von fast 1:1 Streptavidin beschichteten Qdots schnell, Qdot-Label ORC wurde in der λ-ARS317 gefesselte Messzelle gepumpt. DNA wurde mit SYTOX Orange gefärbt. Die Signale des Qdot beschriftet ORC und SYTOX-Orange gefärbten DNA wurden gleichzeitig mit TIRFM (Abb. 3A-3 C) abgebildet. Um die Verteilung der Ork auf λ-ARS317 zu bestimmen, trennte sich der bildgebende Stapel in zwei Stapel: ein Stapel von DNA-Signal und die anderen Stapel von ORC-Signal wie in Schritt 6.1 (Abb. 3 b) beschrieben. Basierend auf der Formel, Position (kb) = (L/lORCDNA) × 50 kb (Abbildung 3D), 273 verbindlich Positionen der ORC-Qdot705 Moleküle auf 168 DNA-Substrate sind quantitativ analysiert. Die Daten zeigten, dass ORC-Qdot705 speziell bindetauf der ARS317 eingefügt-Website mit einer hohen Fülle (Abbildung 3E). ORC-Qdot705 bindet inzwischen auch auf die AT-reichen Gebieten befindet sich in der Mitte und das freie Ende des λ-DNA, die im Einklang mit den Ergebnissen der vorherigen Studie10.
Die qualitativ hochwertige Bildaufnahme hängt das molare Verhältnis von Eiweiß und Qdots in der Kennzeichnung Test. Übermäßige Qdots kann gut sein für das Protein Kennzeichnung Effizienz, aber sie können Hintergrundgeräusche erstellen. Wie in Abbildung 4dargestellt, während der Etikettierung der biotinylierte Ork mit Streptavidin beschichteten Qdots im Molverhältnis 1:3, erhöht die Geräuschkulisse. Daher ist es wichtig, die entsprechenden Molverhältnis biotinylierte Proteine zu Streptavidin beschichteten Qdots wählen.
Abbildung 1: Vorbereitung der λ-ARS317 DNA Substrat. (A) Abbildung der λ-ARS317 Konstruktion. Ein DNA-Fragment mit ARS317 wurde durch homologe Rekombination λ-DNA integriert. (B) Plaques auf festem Medium LB. Drei von ihnen wurden mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. (C) eine λ-ARS317-Gedenktafel wurde mittels PCR identifiziert. (links) Marker, (Mitte) native λ-DNA, (rechts) eine Gedenktafel der λ-ARS317. (D) Purified λ-ARS317 DNA wurde von 0,6 % Agarose-Gelelektrophorese erkannt. (links) Marker, gereinigt (Mitte) native λ DNA (rechts) λ-ARS317. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Übersicht über Ziel-Typ TIRF und Flow Cell. Einzelmolekül bildgebende Tests wurden anhand der TIRFM kombiniert mit Flow-Zelle-System durchgeführt. Unsere TIRFM erfolgte auf einem inversen Mikroskop, ausgestattet mit einem 60 X Öl Ziel (numerische Apertur = 1.49). DNA (graue Linie) wurde auf das Deckglas in der Messzelle durch die Verknüpfung von Biotin-Streptavidin angebunden und erstreckte sich von der Strömung von links nach rechts. Eine Proteinbindung auf die gefesselte DNA wurde durch einen rot-Oval-Punkt angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Qdot705-ORC (Molares Verhältnis 1:1) verbindlich auf λ-ARS317 beschriftet. (A) ORC und λ-ARS317 DNA wurden gleichzeitig beobachtet. (oben) SYTOX Orange gefärbten DNA begeistert mit 532 nm Laser und beobachtet die 550-613 nm Getriebe Band Quadband-Bandpass-Filter nutzen. (unten) Qdot705-beschrifteten ORC war aufgeregt mit einem 405 nm-Laser und beobachtet die 663-743 nm Getriebe Band Quadband-Bandpass-Filter nutzen. (B) zwei 256 × 256 Sub Stapel wurden aus dem ursprünglichen 512 × 512 Stapel abgeschnitten. (C) der Bilder aufgenommen mit 61 sequenzielle Rahmen in den entsprechenden Stapel. (links) SYTOX Orange gefärbten DNA, (mittlere) Qdot705-beschriftet ORC, zusammengeführte Bild (rechts); drei Qdot705-beschrifteten ORC-Bindung an ARS317 Stelle auf λ-ARS317 DNA-Substrate wurden mit schwarzen Pfeilen markiert. (D) Illustration der Berechnung des ORC verbindliche Stellungnahme DNA. LDNA bedeutet die DNA-Länge, LORC bedeutet die Entfernung von ORC Website auf DNA an gefesselte Ende der DNA binden. (E) Histogramm der ORC verbindliche Verteilung auf λ-ARS317 DNA. Gauß an die Daten anpassen wurde durch die rote durchgezogene Linie angezeigt. Fehlerbalken zeigen eine 95 %-Konfidenzintervall auf 1000 bootstrap-Stichproben beruhen. N bedeutet die Anzahl der ORC-Moleküle. ARS317 eingefügt-Website wurde durch ein schwarzer Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Qdot-Label ORC (molaren Verhältnis 3:1) bindend λ-ARS317. ORC und λ-ARS317 DNA wurden in der gleichen Weise wie in Abbildung 3Abeobachtet. (links) SYTOX Orange gefärbten DNA mit 532 nm Laser angeregt wurde. (Mitte) Qdot-Label ORC war begeistert mit einem 405 nm-Laser. (rechts) zusammengeführten Bilder. Zwei Qdot-Label ORC-Bindung an ARS317 Stelle auf λ-ARS317 DNA-Substrate wurden mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und die ortspezifisch modifizierte λ-DNA mit Hilfe der TIRFM in einer Durchflusszelle beobachten. Die notwendigen Schritte sind standortspezifische Modifikation der DNA Substrat, DNA biotinylierungen Deckglas Reinigung und Funktionalisierung, Durchflusszelle Vorbereitung und Einzelmolekül-Bildgebung. Es gibt zwei wichtige Punkte, die beachtet werden sollten. Zunächst werden alle Schritte mit λ-DNA sanft manipuliert werden sollten, um mögliche Schäden, z.B.zu verringern durch pipettieren immer wieder rauf und runter mischen zu vermeiden. Zweitens ist es sehr wichtig sicherzustellen, dass das Deckglas sauber genug ist, um die Hintergrundgeräusche zu minimieren. Während des Deckglases Reinigung und Funktionalisierung, sollte Wasser Reinstwasser Niveau erreichen, und die Luft sollte staubfrei. Es ist besser, das Deckglas Funktionalisierung und Durchflusszelle Montage auf einer sauberen Werkbank durchführen.
In der Einzelmolekül-Assays für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktion ist λ-DNA eine geeignete Substrat mit mehrere Vorteile20. Λ-DNA ist lang genug, um leicht beobachtet werden und erlauben die Aufnahme von Protein Bewegung darauf in einem einzigen Molekül-Experiment. Darüber hinaus erlauben die SsDNA Überhänge viele Entwürfe für tethering λ-DNA auf einem Glas deckgläschen. In dieser Studie stellen wir eine Methode für das Einfügen einer exogene DNA-Fragment an einem bestimmten Standort der λ-DNA. So können verschiedene benutzerdefinierbare DNA-Fragmente in λ-DNA integriert werden. Die modifizierte λ-DNA kann bequem vom flüssigen Lysates in großen Mengen für die Einzelmolekül-Studie gereinigt werden.
Es ist schwer zu beurteilen die Kennzeichnung Effizienz genau in die Streptavidin beschichteten Qdot Assay bezeichnen, denn es etwa 5 bis 10 Streptavidins pro Qdot Nanocrystal gibt. Dementsprechend sollte die entsprechende Molverhältnis von Streptavidin beschichteten Qdots und biotinylierte Proteine in den Experimenten optimiert werden. Einem Molverhältnis von 1:1 kann ein Verweis sein.
Anzumerken ist, dass Qdot in genaue quantitative Tests verwendet werden kann, da seine hohe Lichtstabilität ungeeignet für die Foto-bleichen-Assay ist. Obwohl die hohe Stabilität der Qdots ihre Anwendung in der quantitativen Assays einschränkt, ermöglicht es, einfache Beobachtung und Langzeit Tracking-5. Mit zunehmender Anwendungen der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie in der Biologie das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen wird wesentlich zur Entschlüsselung der Mechanismen der DNA-Stoffwechsel in Zukunft beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Dr. Hasan Yardimci und Dr.Sevim Yardimci des Francis Crick Institute for Art helfen bei der Einzelmolekül-Experimente, Dr. Daniel Duzdevich von Dr. Eric C. Greene-Labor der Universität von Columbia, Dr. Yujie Sun der Peking-Universität und Dr. Chunlai Chen von Tsinghua-Universität für nützliche Diskussion. Diese Studie wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS interdisziplinärer Innovationsteams und die Newton Advanced Fellowship (NA140085) von der Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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