Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att studera DNA-protein interaktioner av totalreflexion fluorescensmikroskopi (TIRFM) med hjälp av ett anläggningsvis modifierade λ DNA-substrat och en Quantum-dot märkt protein.
Abstract
Fluorescensmikroskopi har gjort stora bidrag i dissekera mekanismerna av komplexa biologiska processer på nivån enda molekyl. I enda molekyl analyser för att studera DNA-protein interaktioner, det finns två viktiga faktorer för övervägande: DNA underlaget med tillräcklig längd för enkel observation och märkning ett protein med en lämplig fluorescerande sond. 48,5 kb λ DNA är en bra kandidat för DNA substratet. Kvantprickar (Qdots), tillåta som en klass av fluorescerande sonder, long-time observation (minuter till timmar) och högkvalitativ bild förvärv. I detta papper presentera vi ett protokoll för att studera DNA-protein interaktioner på singel-molekyl nivå, vilket inkluderar förbereder en anläggningsvis modifierade λ DNA och märkning ett målprotein med streptividin-belagd Qdots. För ett proof of concept, vi väljer ORC (ursprung erkännande komplexa) i spirande jäst som ett protein av intresse och visualisera dess interaktion med en ARS (autonomt replikerande sekvens) med hjälp TIRFM. Jämfört med övriga fluorescerande sonder, Qdots har uppenbara fördelar i enda molekyl studier på grund av dess höga stabilitet mot fotoblekning, men det bör noteras att detta boende begränsar dess tillämpning i kvantitativa analyser.
Introduction
Interaktioner mellan protein och DNA är nödvändiga för många komplexa biologiska processer, såsom DNA-replikation, DNA-reparation och transkription. Även konventionella metoder har belyst egenskaperna för dessa processer, är många viktiga mekanismer fortfarande oklart. Nyligen, med de snabbt växande enda molekyl teknikerna, vissa mekanismer har varit adresserade1,2,3.
Tillämpningen av singel-molekyl fluorescensmikroskopi på visualisera protein-DNA-interaktion i realtid huvudsakligen beror på utvecklingen av fluorescens upptäckt och fluorescerande sonder. För en enda molekyl studie är det viktigt att märka proteinet av ränta med en lämplig fluorescerande sond eftersom fluorescens detektionssystem finns mestadels kommersiellt.
Fluorescerande proteiner används ofta i molekylärbiologi. Men begränsar låg fluorescerande ljusstyrka och stabilitet mot fotoblekning dess tillämpning i många enda molekyl analyser. Kvantprickar (Qdots) är små ljusavgivande nanopartiklar4. På grund av deras unika optiska egenskaper, Qdots är 10 - 20 gånger ljusare och flera tusen gånger mer stabil än den utbredda organiska färgämnen5. Dessutom har Qdots en stor Stokes Skift (skillnaden mellan excitation och utsläpp toppar ställning)5. Qdots kan således användas för lång tid observation (minuter till timmar) och förvärvet av bilder med hög signal-brus-förhållanden, medan de inte kan utnyttjas i de kvantitativa analyserna.
I dag finns det två tillvägagångssätt att märka ett målprotein med Qdots anläggningsvis: märkning med hjälp av Qdot-konjugerad primära eller sekundära antikroppar6,7,8. eller märkning målproteinet med Qdots direkt, som är baserad på den starka växelverkan mellan biotin och streptividin9,10,11,12,13. Streptividin-belagda Qdots är kommersiellt tillgängliga. I vår senaste studie, anläggningsvis biotinylerade proteiner i spirande jäst med hög verkningsgrad var renas genom co-överuttryck av BirA och Avi-märkta proteiner i vivo10. Genom följande och optimera den enda-molekyl analyser14,15,16,17, observerade vi interaktioner mellan Qdot-märkta proteiner och DNA på den enda molekyl nivå med TIRFM10.
Här kan vi välja spirande jäst ursprung-erkännande komplexa (ORC), som kan specifikt känna igen och binda till självständigt replikerande sekvensen (ARS), som våra protein av intresse. Följande protokoll presenterar ett stegvis förfarande att visualisera samspelet mellan Qdot-märkt ORC med ARS med TIRFM. Beredning av anläggningsvis modifierad DNA substratet, den DNA-biotinylation, täckglas rengöring och funktionalisering, flöde-cell församlingen och singel-molekyl bildtagning beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av λ-ARS317 DNA substrat
- DNA substrat konstruktion och förpackning
- Smälta infödda λ DNA med hjälp Xhojag enzym; förstärka 543 bp DNA fragment bäring ARS317 genomisk DNA från spirande jäst med primers som innehåller 20 bp homologa sekvenser av uppströms och nedströms Xhojag enzym webbplats på lambda DNA. Tillsätt 100 ng av Xhojag smält λ DNA och 10 ng DNA fragment till 10 µL av homolog rekombination reaktion system och inkubera reaktionen vid 37 ° C i 30 min.
- Om du vill paketera rekombination λ DNA, tillsätt 25 µL av lambda förpackning extrakt i rekombination produkten och inkubera reaktionen vid 30 ° C i 90 min. Lägg sedan till en ytterligare 25 µL av lambda förpackning extrakt i reaktionsröret. Fortsätta att Inkubera reaktionen vid 30 ° C i 90 min.
- Tillsätt 500 µL sterilt förtunningsbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) i systemets reaktion, och blanda försiktigt genom att vrida röret upp och ned flera gånger. Tillsätt 25 µL kloroform, blanda försiktigt och förvaras vid 4 ° C.
- Tillsätt 100 µL av paketerade phage och 100 µL av bakterier LE392MP (odlade på 0,8 - 1,0 på LB medium att lägga med 10 mM MgSO4) in i en ny tub. Inkubera vid 37 ° C i 15 minuter.
- Tillsätt 200 µL av phage-bakterien blandningen i 4 mL oftop agar (LB medium + 0,7% agar + 10 mM MgSO4, kyls till 48 ° C). Blanda omedelbart genom att vrida röret upp och ner flera gånger och häll det på förhand värmde (37 ° C) LB plåt.
- Inkubera plattan vid 37 ° C över natten och skärm λ-ARS317 plack med PCR och sekvensering.
- DNA substrat rening från flytande lysates11,18
- Plocka en plakett till 200 µL sterilt ddH2O med 10 mM MgCl2 och 10 nM CaCl2. Blanda med 200 µL av bakterier LE392MP (odlade övernattning i LB medium) och inkubera vid 37 ° C i 15 min.
- Tillsätt blandningen phage-bakterien i 100 mL av NZCYM (10 g/L NZ-Amin, 5 g/L jäst extrakt, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino hydrolysat och 2 g/L MgSO4·7H2O) medium och kultur för 7 h vid 37 ° C. Tillsätt 250 µL av kloroform i kulturen och skaka i en annan 10 min.
- Överföra kulturen i en 200 mL-mätkolv. Lägga till 5,8 g NaCl (1 M slutlig koncentration), rör om för att lösa upp för hand och inkubera på is i 30 min.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C att ta bort cellfragment. Samla in supernatanten i en 200 mL mätkolv och tillsätt 10% PEG8000 (m/V). Rör för att upplösa vid magnetisk omrörning apparater och inkubera på is för 30 min eller längre.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C utfällning av bacteriophage. Ta bort supernatanten.
- Återsuspendera fällningen i 2 mL förtunningsbuffert phage. Överför till en 15 mL tub och tillsätt 10 µL RNase (slutlig koncentration är 20 µg/mL) och 40 µL av DNAS (slutlig koncentration är 5 µg/mL). Inkubera vid 37 ° C i 30 min.
- Tillsätt 2 mL av 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 µL proteinas K (slutlig koncentration är 10 µg/mL). Inkubera vid 65 ° C i 10 min.
- Tillsätt 2 mL av nedkylda kalium acetat (3 M, pH 4,8) och Inkubera röret på is i 10 min.
- Centrifugera vid 8000 x g i 10 minuter vid 4 ° C ta bort olösligt material.
- Tillsätt 0.7 x volym isopropanol i supernatanten. Blanda genom att vrida röret upp och ner flera gånger, och inkubera i 2 min i rumstemperatur (RT).
- Centrifugera vid 8000 x g i 10 min vid RT utfällning DNA. Ta bort supernatanten.
- Tvätta DNA när med 70% etanol genom centrifugering vid 8000 x g i 10 min. ta bort supernatanten.
- Eluera DNA använder 500 µL TE buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) försiktigt, och överföra DNA till 1,5 mL tub.
- Extrahera DNA två gånger med fenol: kloroform genom centrifugering vid 8 000 g i 10 min.
- Fällningen med 0.7 x volymdelar isopropanol. Blanda genom att vrida röret upp och ned försiktigt och centrifugera vid 8000 x g i 10 min.
- Tvätta en gång med 70% etanol, Återsuspendera i 200 µL av TE. Mätning av DNA-koncentrationen och förvaras vid-20 ° C i 12,5 µg alikvoter.
2. λ-ARS317 DNA Biotinylation
- Att fosforylera biotinylerade oligonukleotider (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotin-3') kompletterar den vänstra änden av native λ DNA, tillsätt 1 µL (100 µM) av oligonukleotider, 7,5 µL av ddH2O, 1 µL 10 x ligase buffert och 0,5 µL av T4 PNK. Inkubera reaktionen vid 37 ° C i 3 h.
- Att fosforylera λ-ARS317, Lägg till 12,5 µg av λ-ARS317, 3 µL 10 x ligase buffert, 1 µL av T4 PNK och ddH2O till total volym av 30 µL. Inkubera reaktionen vid 37 ° C i 3 h.
- För att glödga oligonukleotider med λ-ARS317, tillsätt 0,5 µL av fosforylerade oligonukleotider, 195 µL av ddH2O, 25 µL 10 × ligase buffert i fosforyleras λ-ARS317 röret. Blanda försiktigt genom att vrida röret uppochner och inkubera vid 65 ° C i 5 min. Vänd av motorvärmare, och låt det provet svalna till under 33 ° C i blocket.
- För att ligera oligonukleotider med λ-ARS317, Lägg till 1 µL av T4 DNA-ligase och 0,63 µL av ATP (200 mM). Blanda försiktigt genom att vrida röret uppochner och inkubera i rumstemperatur i 2 h eller 4 ° C över natten. Förvaras vid 4 ° C i 1 månad.
Obs: För att undvika att bryta upp DNA, alla blandande steg bör göras genom att du försiktigt vrida röret upp och ned, i stället för blandning med pipetter.
3. täckglas rengöring och funktionalisering
- Täckglas rengöring
- Placera 20 coverslips i 4 färgning burkar (5 coverslips/burk), Sonikera i 30 minuter i etanol, och skölj coverslips med ultrarent H2O 3 gånger.
- Sonikera i 30 minuter med 1 M kaliumhydroxid (KOH), och skölj coverslips med ultrarent H2O 3 gånger. Upprepa den etanol och KOH ultraljudsbehandling en gång.
- Sonikera med aceton i 30 minuter, och skölj sedan med ultrarena H2O (minst 3 gånger).
Obs: Aceton måste avlägsnas noggrant genom att skölja med ultrarena H2O, eftersom det kan orsaka en explosion när organiskt lösningsmedel (t.ex. aceton) blandat med piranha lösningen av misstag14. - Placera coverslips i piranha lösning (3:1 blandning av H2SO4 och 30% H2O2) och inkubera vid 95 ° C i 1 h.
Obs: Piranha lösning är mycket energisk och erosiv, så Använd med försiktighet. När du förbereder piranha lösning, tillsätt 50 mL H2O2 först till en 500 mL-glasbägare och sedan lägga 150 mL H2så4 långsamt i bägaren. - Skölj coverslips med ultrarent H2O 5 gånger. Sedan tvätta varje täckglas med ultrarena H2O noga med 3 bägare fylld med ultrarena H2O, och torka den täckglas använder papper från kanten av täckglaset. Placera täckglaset i färgning burken och torka täckglaset grundligt i 110 ° C ugn i 30 minuter.
- Skölj täckglaset med metanol och placera färgning burken i 110 ° C ugnen igen för att torka täckglaset ordentligt.
Obs: Torkning av täckglas grundligt är mycket viktigt, eftersom APTES kommer att ha massor av möjliga ytstrukturer när den är i närvaro av vatten19.
- Skölj täckglaset med metanol och placera färgning burken i 110 ° C ugnen igen för att torka täckglaset ordentligt.
- Täckglas funktionalisering
- Tillsätt 70 mL silan (93% metanol, 5% ättiksyra och 2% APTES) i varje burk, skruva på locket och lämna burken i rumstemperatur över natten.
- Tvätta och torka coverslips som beskrivs i steg 3.1.5, förutom torka den coverslips grundligt med kvävgas i stället för att placera dem i ugnen.
- Lös 150 mg av mPEG (metoxi-polyetylenglykol) och 6 mg biotin-PEG (biotin-polyetylenglykol) till 1 mL 0,1 M färska-made NaHCO3 (pH 8,2) noggrant. Sedan Centrifugera vid 17, 000 x g för 1 min att avlägsna olösliga pinnar.
Obs: Nybakade NaHCO3 är redo; Det finns ingen anledning att justera dess pH. - Placera den silaniserad coverslips i lådor och sätta två små coverslips överst på båda ändarna av den silaniserad coverslips. Pipettera 100 µL av PEG lösning på mitten av det silaniserad täckglaset och placera en annan silaniserad täckglas på toppen.
- Lägg några ultrarena H2O i rutan att hålla det fuktigt och inkubera i coverslips med PEG lösning för minst 3 h i mörkret. En över natten inkubation kan fungera lika bra.
- Separata täckglas paren och hänga functionalized ytan ansiktet, skölj den coverslips använder ultrarena H2O utförligt och torka dem med kvävgas.
- Markera den functionalized sidan av coverslips på ett av hörnen med en tuschpenna, hålla functionalized sidan uppåt, placera dem i rutor och förvara rutorna i den vakuum exsickatorn för 1 månad.
- För att lagra coverslips under en längre tid, placera ett täckglas i en 50 mL tub borras med ett hål på sin mössa, och sedan placera röret i en plastpåse och förslut påsen med ett vakuum sealer. På detta sätt kan coverslips lagras vid-20 ° C ca 3 månader.
4. flödet Cell församling
- Skär en 15 mm × 2 mm kanal i mitten av en bit dubbelhäftande tejp (30 mm × 12 mm) med ett hålslag.
- Dra av papperet sidan av den dubbelhäftande tejpen och klistra in den i glas bilden med två hål. Tryck för att avlägsna luftbubblor. Baserat på vår erfarenhet, är det lättare att avlägsna luftbubblor genom att dra bort den papper sidan än plast sidan av den dubbelhäftande tejpen.
- Skär ett functionalized täckglas (60 mm × 24 mm) i fyra bitar (30 mm × 12 mm) med en diamantbestyckade glas scribe och ta bort skräpet med kvävgas. Kom ihåg att hålla den functionalized sidan vänd uppåt.
- Lossnar den plastiska sidan av den dubbelhäftande tejpen, och klistra in bilden på det functionalized täckglaset. Tryck försiktigt för att avlägsna luftbubblor mellan täckglaset och bandet. Ta bort luftbubblor grundligt kan skydda cellen flöde från läckande medan buffertar pumpades in i den.
- Infoga inlopp och utlopp slang i små och stora hål, respektive. Fäst slangen med epoxi.
- Pumpa 20 µL av streptividin (0,2 mg/mL) i flöde cell med en spruta manuellt och inkubera vid RT i 10 min. Sedan pumpa blockerande buffert10 i flöde cell att ersätta streptividin och förvara det i rumstemperatur.
5. enda molekyl visualisering
- Få fokus justering av röda och mån med A5 i fluorescens Mikroskop test bilden #1 genom samtidig excitation med en 532 nm laser och en 640 nm laser. Producera spektrofotometer bilder med uppdelning optik (se Tabell för material).
- Placera cellen flöde på mikroskopet och Anslut dess utlopp slang till en längre slang som ansluter med en 10 mL våren installerad på en automatiserad infusion/uttag programmerbara pumpen.
Obs: Pumpa buffertar i cellen flöde som nämns nedan innebär att återkalla buffertar från inlopp slangen av cellen flöde på sprutan. - Pumpa blockerande buffert vid 500 µL/min i cellen flöde att avlägsna luften snabbt och säkerställa att bufferten i cellen flöde är avblockerad. Sedan pumpa det blockerande buffert vid 200 µL/min i cellen flöde och flip outlet slangen för att ta bort luftbubblor från inlopp slangen och cellen flöde noggrant.
Obs: Alla buffertar pumpas in i cellen flöde bör avgasas i vakuum exsickator i minst 15 minuter före användning. - Tillsätt 0,5 µL av biotinylerade λ-ARS317 DNA i 80 µL blockerande buffert och pumpa det i cellen flöde på 25 µL/min i 2 min. Sedan spola λ-ARS317 DNA med 200 µL blockerande buffert vid en hastighet av 50 µL/min.
- Pumpa 200 µL bindande buffert10 med en hastighet av 50 µL/min att ta bort det blockerande buffert i cellen flöde.
- Tillsätt 0,2 µL av streptividin-belagda Qdot705 (1 µM) och 0,2 µL av biotinylerade ORC (1,2 µM) i ett rör, och odla i rumstemperatur i 5 min. Sedan Tillsätt 20 µL av bindande buffert i röret, och placera den på isen. Den slutliga koncentrationen av ORC-Qdot705 är ca 10 nM.
- Tillsätt 2 µL av ORC-Qdot705 (10 nM), 1 µL DTT (100 mM), 1 µL av ATP (200 mM) till 96 µL av bindande buffert. Den slutliga koncentrationen av ORC-Qdot705 är 0,2 nM.
- Pumpa 20 µL av 0,2 nM ORC-Qdot705 uppgå till 10 µL/min i cellen flöde. Spola ut av överdriven ORC-Qdot705 använder 200 µL av bindande buffert uppgå till 100 µL/min. Sedan pumpa bindande buffert med 30 nM SYTOX Orange i cellen flöde att färga DNA substrat med en hastighet av 100 µL/min.
- Excitera ORC-Qdot705 signalen och SYTOX Orange färgade DNA signal med en 405 nm laser och 532 nm laser, respektive. Observera signaler samtidigt med 100 µL/min flöde med ett Quad-band bandpassfilter (FF01-446/510/581/703-25) och registrera bilder av EM-CCD med 100 ms per bildruta. Samla in 20 bildstaplar från olika områden.
6. dataanalys
- Beskär bilderna med Fiji programmet med en ny plugin, som är den av oss själva utifrån den bild-plugin (OI_cut_RGBmerge) som utvecklats av Dr Ron Vales lab vid University of California, San Francisco.
- Beskära en bunt med bilder (512 × 512 pixlar) i två högar av bilder (256 × 256 pixlar). En är en 532 nm laser spännande resultat, och den andra är en 405 nm laser spännande resultat.
- Bearbeta 61 sekventiell bilder med hjälp av Fiji-bild-stackar-Z project (genomsnittliga intensitet).
- Mått Längd DNA (LDNA) och avståndet från platsen för ORC-Qdot705 (LORC) bindande DNA till DNAS uppbundna slutet manuellt.
- Beräkna resultatet av LORC/lDNA använder excel, analysera data med hjälp av metoden bootstrap av R, och sedan skapa histogrammet och passa Gaussiska fördelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visualisera samspelet mellan Qdot-märkt ORC och ARS, konstruerade vi först λ-ARS317 DNA substratet. En DNA-fragment som innehåller ARS317 integrerades in i Xhosite jag (33,5 kb) av infödda λ DNA av homolog rekombination (figur 1A). Rekombination produkten levererades med extrakt och paketerade phage partiklarna odlades på LB tallrikar (figur 1B). Den positiva phage placken visades med PCR och bekräftas av sekvensering (figur 1 c). Λ-ARS317 DNA renades från den flytande lysates (figur 1 d).
Singel-molekyl imaging analyser utfördes på mål-typ TIRFM set-up (figur 2). Genom märkning på biotinylerade ORC med en nästan 1:1 molar förhållandet streptividin-belagda Qdots snabbt, Qdot-märkt ORC pumpades in i λ-ARS317 uppbundna flöde cellen. DNA var målat med SYTOX Orange. Signalerar av Qdot-märkta ORC och SYTOX-Orange-färgade DNA var avbildade samtidigt med TIRFM (figur 3A-3 C). För att bestämma fördelningen av ORC på λ-ARS317, imaging stacken var separerade i två högar: en stack av DNA signal och andra stacken av ORC signal som beskrivs i steg 6.1 (figur 3B). Baserat på formeln, Position (kb) = (L/lORCDNA) × 50 kb (figur 3D), 273 bindande positioner av ORC-Qdot705 molekyler på 168 DNA substrat var kvantitativt analyserade. Data visade att ORC-Qdot705 speciellt binder på ARS317 införas webbplats med ett självklart hög överflöd (figur 3E) . ORC-Qdot705 binder samtidigt också på AT-rika områden ligger i mitten och den fria änden av λ DNA, vilket överensstämmer med resultaten av den föregående studien10.
Högkvalitativ bild förvärvet beror på molar förhållandet av protein och Qdots i märkning analysen. Överdriven Qdots kan vara bra för proteinet märkning effektivitet, men de kan skapa bakgrundsljud. Som visas i figur 4, medan märkning biotinylerade ORC med streptividin-belagda Qdots på 1:3 molar förhållandet, ökade bakgrund buller. Således är det viktigt att välja lämpliga molar förhållandet av biotinylerade proteiner till streptividin-belagd Qdots.
Figur 1: förberedelse av λ-ARS317 DNA substrat. (A) Illustration av λ-ARS317 konstruktion. En DNA-fragment som bär ARS317 integrerades i λ DNA av homolog rekombination. (B) plack på LB fast medium. Tre av dem var markerade med svarta pilar. (C) en λ-ARS317 plack identifierades med PCR. (vänster) Markör, (mitten) infödda λ DNA, (höger) en plakett av λ-ARS317. (D) renat λ-ARS317 DNA upptäcktes av 0,6% agaros gelelektrofores. (vänster) Markör, (mitten) infödda λ DNA (höger) renat λ-ARS317. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk översikt av mål-typ Frida och flöde cell. Enda molekyl imaging analyser genomfördes utifrån den TIRFM som kombinerar med flöde cellsystem. Våra TIRFM utfördes på ett inverterat Mikroskop som är utrustat med en 60 X olja mål (numerisk bländare = 1.49). DNA (grå linje) var uppbundna på täckglas i cellen flöde genom biotin-streptividin kopplingen och sträckt av flödet från vänster till höger. En proteinbindning på uppbundna DNA indikerades av en röd-oval prick. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Qdot705-märkt ORC (1:1 molar förhållandet) bindande för λ-ARS317. (A) ORC och λ-ARS317 DNA observerades samtidigt. (överst) SYTOX Orange färgade DNA var upphetsad med hjälp av en 532 nm laser och observerade använder frekvensbandet 550-613 nm överföring av quad-band band-passera filter. (botten) Qdot705-märkta ORC var upphetsad med hjälp av en 405 nm laser och observerade använder frekvensbandet 663-743 nm överföring av quad-band band-passera filter. (B) två 256 × 256 sub stackar var beskuren från den ursprungliga 512 × 512 stacken. (C) bilderna förvärvade 61 sekventiell ramsida i de motsvarande högarna. (vänster) SYTOX Orange färgade DNA, (mitten) Qdot705-märkt ORC, (höger) sammanfogad bild; tre Qdot705-märkta ORC bindande på ARS317 webbplats på λ-ARS317 DNA substrat markerades med svarta pilar. (D) Illustration av beräkningen av ORC bindande position på DNA. L-DNA betyder DNA längd, LORC avses avståndet från ORC bindande webbplats på DNA till uppbundna slutet av DNA. (E) Histogram av ORC bindande distribution på λ-ARS317 DNA. Gaussisk passar till data angavs med hjälp av den röda heldragna linjen. Felstaplar visar ett 95% konfidensintervall baserat på 1000 bootstrap prover. N betyder antalet ORC molekyler. ARS317 infogas webbplats angavs med en svart pil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Qdot-märkt ORC bindande (3:1 molar förhållandet) på λ-ARS317. ORC och λ-ARS317 DNA observerades på samma sätt som i figur 3A. (vänster) SYTOX Orange färgade DNA var upphetsad med hjälp av en 532 nm laser. (i mitten) Qdot-märkt ORC var glada med en 405 nm laser. (höger) sammanfogade bilder. Två Qdot-märkt ORC bindande på ARS317 webbplats på λ-ARS317 DNA substrat markerades med svarta pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för att observera samspelet mellan Qdot-märkt proteinet och anläggningsvis modifierade λ DNA med TIRFM i ett flöde-cell. Nödvändiga åtgärder inkluderar platsspecifika modifiering av DNA substrat, DNA biotinylation, täckglas rengöring och funktionalisering, flöde-cell förberedelse och singel-molekyl imaging. Det finns två viktiga punkter som bör noteras. Först, alla de olika stegen med λ DNA bör manipuleras försiktigt för att minska eventuella skador, t.ex., att undvika blanda av pipettering upp och ner flera gånger. Andra, det är mycket viktigt att säkerställa att täckglaset är tillräckligt rent för att minimera dess bakgrundsljud. Under täckglas rengöring och funktionalisering, vattnet ska nå ultrarena nivå, och luften bör vara dammfria. Det är bättre att utföra täckglas funktionalisering och flöde-cell montering på en ren bänk.
I de enda molekyl-analyserna för att studera protein-DNA-interaktion, är λ DNA ett lämpligt substrat med flera fördelar20. Λ DNA är lång nog att observeras enkelt och tillåta inspelning protein rörelse på det i en enda molekyl experiment. Dessutom tillåta ssDNA överhäng många mönster för Internetdelning λ DNA på ett täckglas. I denna studie presenterar vi en metod för att infoga ett exogent DNA-fragment på en specifik plats av λ DNA. Således kan olika användardefinierade DNA-fragment integreras i λ DNA. Modifierade λ DNA kan bekvämt renas från flytande lysates i stora mängder för enda molekyl studie.
Det är svårt att bedöma exakt i den streptividin-belagda Qdot märkning analys eftersom det finns cirka 5-10 streptavidins per Qdot fysikalisk märkning effektiviteten. Därför bör lämpliga molar förhållandet av streptividin-belagda Qdots och biotinylerade proteiner optimeras i experimenten. En 1:1 molar förhållandet kan vara en referens.
Det bör noteras att Qdot inte kan användas i korrekt kvantitativa analyser eftersom dess hög foto-stabilitet är olämpliga för foto-blekning analysen. Även om hög stabilitet av Qdots begränsar dess tillämpning i de kvantitativa analyserna, tillåter det enkel observation och lång tid spårning5. Med ökande tillämpningar av singel-molekyl fluorescensmikroskopi i biologi, protokollet beskrivs i denna uppsats kommer att kraftigt bidra till nysta upp mekanismer för DNA ämnesomsättning i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Hasan Yardimci och Dr.Sevim Yardimci av Francis Crick Institute for typ hjälpa i singel-molekyl experiment, Dr. Daniel Duzdevich från Dr. Eric C. Greenes lab av Columbia University, Dr Yujie Sun av Pekings universitet och Dr. Chunlai Chen av Tsinghua University för nyttig diskussion. Denna studie stöddes av den naturliga vetenskapen Foundation Kinas nationella 31371264, 31401059, CAS tvärvetenskapliga Innovation Team och Newton avancerade gemenskap (NA140085) från Royal Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25x36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25x36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S.
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
