Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. er fælles patogener tilskrives diarré. Her, vi beskriver en høj overførselshastighed platform for screening af Salmonella spp. /Shigella spp. ved hjælp af real-time PCR kombineret med guidet kultur.

Abstract

Fækal-oral transmission af akut gastroenteritis forekommer fra tid til anden, især når folk, der håndteres fødevarer og vand er smittet med Salmonella spp./Shigella spp. Guld standard metoden til påvisning af Salmonella spp./Shigella spp. er direkte kultur, men dette er arbejdskrævende og tidskrævende. Her beskriver vi en høj overførselshastighed platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, ved hjælp af real-time polymerase kædereaktion (PCR) kombineret med guidet kultur. Der er to større faser: real-time PCR og guidet kultur. For den første fase (real-time PCR) vi forklare hvert trin i metoden: prøve samling, før berigelse, DNA-ekstraktion og real-time PCR. Hvis real-time PCR er positiv, så den anden fase (guidede kultur) udføres: selektiv kultur, biokemiske identifikation og serologiske karakterisering. Vi også illustrere repræsentative resultater, der genereres fra det. Protokollen beskrevet her ville være en værdifuld platform for hurtig, specifikke, følsomme og høj overførselshastighed screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

Diarré er stadig en fælles spørgsmål om sundhed med en høj incidens Vurder globalt1,2. Selvom dødeligheden er relativt lav, nogle patienter viser forskellige symptomer for uger (f.eks. løs og vandig afføring, en hastesag at gå på toilettet), hvilket gør den socioøkonomiske indvirkning meget høj3,4. Mere alvorligt, nogle patienter kan selv udvikle irritabel tyktarm, hvis venstre ubehandlet5. Der findes mange forskellige slags bakterier, virus og parasitter, der kan forårsage diarré6. Salmonella spp. /Shigella spp. er blandt de mest almindelige bakterier til transmission af akut gastroenteritis7,8,9,10,11. Derfor, mange amter har udstedt love eller regler for regelmæssig Salmonella spp. /Shigella spp. screening blandt mennesker, der vil håndtere mad og vand. For eksempel, den kinesiske regering har udstedt love for obligatorisk Salmonella spp. /Shigella spp. screening en gang om året.

Metoden guldstandarden for Salmonella spp. /Shigella spp. opdagelse er bakterier kultur. Gennem bakterier kultur og successive biokemiske identifikation og serologiske karakterisering, kan vi identificere arterne af bakterier, som kan lette sygdom udbrud management og antimikrobiel profilering for at støtte til behandling af patienter 12. det kan også hjælpe med at spore kilden til infektionen i løbet af Salmonella spp. /Shigella spp. udbrud13. Men denne metode er arbejdskrævende (kræver manuel betjening) og tidskrævende (tage flere dage), især for test af et stort antal prøver7. Derudover levedygtige men ikke-bestemmelse (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kan findes i nogle afføringsprøver14. I betragtning af disse ulemper, mange laboratorier har forsøgt at udvikle nye teknikker til påvisning af Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. alle disse metoder bruger nukleare syre forstærkning test (NAAT), blandt hvilke Polymerasekædereaktionen (PCR) er den mest almindelige. En stor begrænsning af disse NAAT baseret metoder er, at døde bakterier, selv bakteriel snavs indeholder ufuldstændige genomisk DNA, kunne vise positive resultater26, som i vid udstrækning kunne påvirke de præcis diagnose af sygdommen. Blanco et al. viste, at Molekylær analyse er meget følsomme, ikke kun til levedygtige Salmonella i kulturer, men også til delvis genomer og døde eller ikke-levedygtige bakterier fra tidligere infektioner eller kontaminering26. Derfor bør der udvikles ny teknologi.

Her, beskrev vi en roman metode at kombinerer NAAT baseret metode og dyrkning. Som vist i figur 1, denne nye metode gælder real-time PCR screening først og derefter positive prøver sendes til bakterier kultur og identifikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen følger retningslinjerne, af den menneskelige videnskabsetisk Komité i Zhuhai International Travel Healthcare Center. Brug venligst standard sterile operation under eksperimentet.

1. kultur medier sammensætning og forberedelse

  1. Forbereder næringsstoffer bouillon: Opløs 1% pepton, 0,3% oksekød ekstrakt, 0,5% natriumchlorid og 0,1% glukose i H2O, justere pH 7,5 og autoklave det i 121 ° C i 15 min.
  2. Forberede Selenite cystin medium: Opløs 0,5% pepton, 0,4% lactose, 1% Na2HCO3, 0,4% natrium brint selenite, 0,001% L-cystin i H2O, justere pH 7.0 og kog det i 5 min.
  3. Forberede Xylose, lysin, Deoxycholate agar (XLD) plade: opløses 0,3% gær extract, 0,5% L-lysin, 0.375% xylose, 0,75% lactose, 0,75% saccharose, 0,5% natriumchlorid, 0,008% phenol rød, 0,68% natrium thiosulfate, 0,08% ammonium jern citrat, 0,25% natrium deoxycholate, 1,5% agar i H2O, og justere pH 7,4. Derefter koges det i 5 min og hæld det i 90 mm plader.
  4. Forberede Salmonella kromogent agar plade: opløses 1,5% agar, 0,7% pepton og gær ekstrakt, 1,29% selektive reagens i H2O. Derefter koges det i 5 min og hæld det i 90 mm plader.
  5. Forberede Nutrient agar plade: Opløs 1% pepton, 0,3% oksekød ekstrakt, 0,5% natriumchlorid, 1,5% agar i H2O, og justere pH til 7,3. Derefter autoklave det i 121 ° C i 15 min og hæld det i 90 mm plader.
  6. Forberede MacConkey agar (MAC) plade: Opløs 2% pepton, 1% lactose, 0,5% natriumchlorid, 0,5% OX galde Salt, 0.0025% Neutral Red, 1,5% agar, 0,0001% krystalviolet i H2O, og justere pH til 7,2. Derefter autoklave det i 115 ° C i 20 min. og hæld det i 90 mm plader.

2. real-time PCR

  1. Prøvetagning
    1. Indsæt en anal vatpind ind i patientens anus 3-5 cm dyb, og rotere 360° rundt.
    2. Sætte anal svaber i en steril collection tube. Mark prøve ID.
    3. Send prøven til laboratoriet hurtigst muligt.
      Bemærk: Prøver kan opbevares ved 4 ° C i højst 24 timer.
  2. Før berigelse
    1. Tilføj 3 mL af næringsstof bouillon i hver stikprøve i collection tube.
    2. Der inkuberes ved 36 ° C 6 h i en inkubator.
  3. Prøven blandes (valgfri)
    1. Indsamle 100 µL af hver enkelt præ berigelse kultur og blande 8-10 prøver af 1 modellen i en 1,5 mL tube, hvis der er mere end 10 prøver.
    2. Mærket korrekt.
  4. DNA-ekstraktion
    1. Centrifugeres pre berigelse kultur ved 800 x g i 2 min så store partikler at slå sig ned, og overførsel af supernatanten til en ny tube og centrifugeres ved 12.000 x g i 5 min. supernatanten ved aspiration.
    2. Tilsæt 100 µL af DNA ekstraktionsopløsning (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) til pelleten. Vortex kraftigt i 1 min.
    3. Koges ved 100 ° C i 5 min på en tør bad.
    4. Der centrifugeres ved 12.000 x g i 5 min. indsamle supernatanten ved hjælp af en ny tube, som bliver skabelonen til den efterfølgende real-time PCR analyse.
  5. Real-time PCR
    1. Setup reaktionsblanding som følger: til hver prøve, tilføje 12,5 µL af 2 x reaktionsblandingen, 0,4 µM hver primer, 0,2 µM hver probe (sekvenser i tabel 1)27, 5 µL af skabelonen, som er udarbejdet i trin 2.4.4 og bruge ddH2O for at tilføje op til 25 µL samlede volumen.
    2. Setup programmet cykling som følger: 95 ° C i 3 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s, 55 ° C til 30 s, 72 ° C til 34 s. indsamle fluorescerende signaler fra 6-carboxy-fluorescein (FAM) og Hexachlorofluorescein (HEX) kanaler på trinnet brudforlængelse (72 ° C) automatisk af den fluorescerende real-time PCR-maskine.
    3. Udfør real-time PCR på en fluorescerende real-time PCR maskine, efter instrukser af instrumentet.
    4. Gå til trin 4 direkte og udstede negative rapporter om negative resultater forekomme på FAM/HEX-kanaler, hvilket betyder, at prøver er negative for Salmonella spp. /Shigella spp.
    5. Gå til trin 3.1 og/eller 3.2 Hvis positive resultater forekomme i HEX og/eller FAM kanaler, hvilket betyder, at prøven kan være positiv for Salmonella spp. og/eller Shigella spp., henholdsvis.
      Bemærk: Hvis prøven blanding er udført i trin 2.3, derefter real-time PCR på individuelle prøver, som består en positiv bør udføres for at frasortere de rigtig positiv prøve.

3. guidet kultur

  1. Salmonella spp. PCR positiv prøve
    1. Selektiv kultur i medium
      1. Tilsættes 100 µL af pre berigelse kultur i 5 mL af Selenite cystin medium i et reagensglas. Der inkuberes ved 36 ° C i 18 – 24 timer i en inkubator.
    2. Adskille kultur på plade
      1. Indsamle en løkke af kultur med en mikro-loop og spredes på en XLD plade eller Salmonella kromogent agar plade. Inkuber ved 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
    3. Biokemiske identifikation
      1. Vælg mistænkelige koloni på XLD plade (pink koloni med/uden mørke hjerte; mørk koloni, gul koloni med/uden mørke hjerte) eller Salmonella kromogent agar plade (lilla eller prunosus koloni, glatte og runde) (figur 2).
      2. Emnet mistænkelige koloni for biokemiske identifikation på automatiseret mikrobielle identifikationssystem, efter instrukser af instrumentet.
    4. Serologisk karakterisering
      1. O antigen karakterisering
        1. Tilføj en dråbe af O antigen polyvalente sera en ren diaset.
        2. Indsamle en løkke af kolonien med en mikro-loop og slibe i seraene.
        3. Gå til trin 3.1.4.1.4 Hvis det ligner flyder sand, hvilket betyder, at kolonien er reaktiv at sera (figur 3). Ellers skal du gå til trin 3.1.4.1.5.
        4. Brug O antigen monovalent sera til at gentage trin 3.1.4.1.1 til 3.1.4.1.3, indtil den særlige O antigen er karakteriseret.
        5. Brug Vi sera for at gentage trin 3.1.4.1.1 til 3.1.4.1.3. Indsamle de Vi sera reaktive kolonier i et rør og kog ved 100 ° C i 5 min i en tør bad. Centrifuger på 12.000 x g i 5 min. indsamle pellet og gentage trin 3.1.4.1.1 til 3.1.4.1.4 indtil bestemt O antigen er karakteriseret.
      2. H antigen karakterisering
        1. Tilføj en dråbe af H antigen polyvalente sera en ren diaset.
        2. Indsamle en løkke af kolonien med en mikro-loop og slibe i seraene.
        3. Gå til trin 3.1.4.2.4 Hvis det ligner flyder sand, hvilket betyder, at kolonien er reaktiv at seraene.
        4. Bruge H antigen monovalent sera til Gentag trin 3.1.4.2.1 for 3.1.4.2.3 indtil bestemt H antigen er karakteriseret.
          Bemærk: Nogle gange serum induktion kan være nødvendigt at karakterisere den anden fase H antigen. Bekræftende, skal derefter følgende valgfrie trin udføres.
        5. (Valgfrit) Tilføj en dråbe af specifikke H antigen sera på Nutrient agar plade. Vent, indtil alle sera er absorberet.
        6. (Valgfrit) Indsamle en løkke af kolonien med en mikro-loop og spredning på pladen hvor specifikke H antigen sera er absorberet. Inkuber ved 36 ° C i 18-24 h i en inkubator.
        7. (Valgfrit) Bruge H antigen monovalent sera til at gentage trin 3.1.4.2.1 til 3.1.4.2.3, indtil anden fase H antigen er karakteriseret.
        8. Gå til trin 4.
  2. Shigella spp. PCR positiv prøve
    1. Adskille kultur på plade
      1. Indsamle en løkke af pre berigelse kultur med en mikro-loop og spredes på en XLD plade eller MAC plade. Der inkuberes ved 36 ° C i 18 – 24 timer i en inkubator.
    2. Biokemiske identifikation
      1. Indsamle mistænkelige koloni på XLD plade (glat, rund, gennemsigtig og røde koloni) eller MAC plade (glat, rund, gennemsigtig og farveløs koloni med 2-3 mm i diameter; Shigella sonnei kan være større og drej til lys pink som forlængelse af inkubationstiden) (figur 4).
      2. Emnet mistænkelige koloni for biokemiske identifikation på automatiseret mikrobielle identifikationssystem, efter instrukser af instrumentet.
    3. Serologisk karakterisering
      1. Tilføj en dråbe af Shigella spp. polyvalente sera en ren diaset.
      2. Indsamle en løkke af kolonien med en mikro-loop og slibe i seraene.
      3. Gå til trin 3.2.3.4 Hvis det ligner flyder sand, hvilket betyder, at kolonien er reaktiv at seraene.
      4. Bruge Shigella spp. monovalent sera til at gentage trin 3.2.3.1 til 3.2.3.3 indtil specifikke Shigella spp. er karakteriseret.
      5. Gå til trin 4.

4. rapport

  1. Udstede positive eller negative rapporter i henhold til de ovennævnte resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen blev anvendt til screening af Salmonella spp. /Shigella spp. i anal fæces prøver fra folk, der vil håndtere mad og vand.

I real-time PCR trin, som vist i figur 5A, var der en vellykket forstærkning i HEX kanal, hvilket betød, at den blandede prøve blev testet positiv for Salmonella spp. Så en yderligere real-time PCR blev gennemført på individuelle prøver, som består en positiv. Som vist i figur 5B, var prøve 2 positive. Derfor blev prøve 2 valgt for den guidede kultur af Salmonella spp. I figur 5Cvar der en vellykket forstærkning i FAM-kanal, som betød, at den blandede prøve var positive for Shigella spp. Så en yderligere real-time PCR blev gennemført og prøven 10 fandtes for at være positiv (fig. 5D). Derfor blev prøve 10 valgt for den guidede kultur af Shigella spp.

I guidet kultur af Salmonella spp. var der pink kolonier og lilla kolonier på XLD og Salmonella kromogent agar plader, separat, som vist i figur 2. Derefter blev disse kolonier udsat for biokemiske identifikation på automatiseret mikrobielle identifikationssystem. Resultaterne viste, at det var Salmonella spp., arter ukendt. Serologisk karakterisering var derfor udføres (figur 3) og det var reaktiv til O4, O12, Hb, H1, 2. Ifølge ordningen med hvid-Kauffmann-Le mindre var prøve 2 endelig rapporteret som positiv for Salmonella paratyphi B. Mens for den guidede kultur af Shigella spp., var der pink rød og farveløs kolonier på XLD og MAC plader, separat, som vist i figur 4. Derefter blev disse kolonier også udsat for biokemiske identifikation på automatiseret mikrobielle identifikationssystem. Resultaterne viste, at det var Shigella sonnei. For at bekræfte sin specifikke serotype, serologisk karakterisering blev udført (figur 3) og det var reaktiv til sonnei fase II. Derfor blev prøve 10 endelig rapporteret som positive for Shigella sonnei fase II.

Figure 1
Figur 1 : Diagram over protokollen. To hovedtrin blev vist og adskilt af bindestreg linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant kultur resultaterne af Salmonella spp. på XLD og Salmonella kromogent agar plader. På XLD plade, der var pink kolonier med/uden mørke hjerte, mens på Salmonella kromogent agar plade, der var lilla kolonier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentativ serologisk karakterisering resultat. Hvis kolonien var reaktiv at seraene, lignede det flyder sand (til venstre). Ellers, det var grumset (højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Repræsentant kultur resultaterne af Shigella spp. på XLD og MAC plader. På XLD plade, der var røde kolonier, mens du er på MAC plade, der var gennemsigtig og farveløs kolonier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Repræsentative real-time PCR resultater. (A) HEX kanal blanding prøver. (B) HEX kanal for individuelle prøver. (C) FAM kanal blanding prøver. (D) FAM kanal for individuelle prøver. PC: positiv kontrol. NC: negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Patogenet Navn Sequence(5'-3')
Salmonella Sal-F
Sal-R
Sal-sonde		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-sonde		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tabel 1: primere og sonder anvendes. Navn og sekvenser af primere og sonder blev fremlagt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden Salmonella spp. /Shigella spp. er ofte forbundet med madforgiftning og fækal-oral transmission af akut gastroenteritis28,29 og rutinemetoden er enten arbejdskrævende eller tidskrævende 7, vi beskriver en høj overførselshastighed platform for Salmonella spp. /Shigella spp. screening, ved hjælp af real-time PCR kombineret med guidet kultur.

Der er flere trin, der har brug for at maksimere evnen til denne platform. Den første er trinnet før tilsætning af prøver i næringsstof bouillon (trin 2.2). Selvom ingen pre berigelse trin er påkrævet for afføringsprøver indsamlet fra disse patienter med tydelige symptomer, såsom diarré, osv., er en generel 6 h før berigelse skridt stadig behov for anal svaberprøver, når indsamlet under præ-beskæftigelsen fysisk undersøgelse for folk, der vil håndtere mad og vand, som disse mennesker var hovedsagelig sund eller i det mindste asymptomatiske voksne. Hvis protokollen blev kun anvendt til påvisning af Salmonella spp., kunne derefter pre berigelse gennemføres i Selenite cystin medium for at øge følsomheden. Det andet vigtige skridt er identifikation af mistænkelige kolonier (trin 3.1.3.1 og 3.2.2.1). Der er mange interfererende baggrund flora i afføringsprøver, som kan maskere detektion og isolering af target patogener30. Derfor, karakteristisk for de mistænkelige kolonier som defineret i trin 3.1.3.1 og 3.2.2.1 bør holdes for øje under eksperimentet. Det tredje kritiske trin er den serologiske karakterisering af Salmonella spp. Da et flertal af Salmonella spp. indeholder en anden fase for H antigen31, skal serum induktion udføres. Men serum induktion er ikke altid vellykket, og flere runder af induktion kan være nødvendigt at bestemme den korrekte anden H fase.

Protokollen er yderst specifik og følsom som bekræftet af vores tidligere undersøgelse27. Høj specificitet af protokollen fremgår af dens evne, i hvilke Salmonella spp. /Shigella spp. kunne skelnes fra andre relaterede patogener27. Den nedre grænse for påvisning af protokollen er 104 CFU/mL og 103 CFU/mL for Salmonella spp. og Shigella spp., henholdsvis27, som kan sammenlignes med tidligere rapporter7,32 , 33 , 34. som ovenfor nævnt følsomheden af Salmonella spp. detektion kunne øges yderligere ved Selenite cystin pre berigelse hvis protokollen blev kun anvendt til påvisning af Salmonella spp. Derudover protokollen kunne øge de positive sats af to folder og mindske arbejdsbyrden/median turnaround tid betydeligt27.

I lighed med andre NAAT assays, en stor begrænsning af protokollen, i forhold til klassiske bakterier kultur metode, er at protokollen kun kunne identificere Salmonella spp. /Shigella spp., mens andre almindelige diarré-forårsager bakterier er udeladt7. I modsætning hertil under klassiske bakterier kultur, kunne disse bakterier identificeres parallelt hvis de eksisterede. En anden begrænsning i protokollen er der nogle af Salmonella spp. /Shigella spp. kunne ikke identificeres af real-time PCR på grund af sekvens variationer27. Men hvis negativ real-time PCR resultaterne vises for disse prøver fra patienter med tydelige kliniske symptomer, laboranter bør være opmærksomme på og kan udføre andre eksperimenter for at bekræfte resultaterne. Under et stort udbrud, kan vi bruge en enkelt prøve i stedet for poolede prøver i første runde af PCR screening.

Afslutningsvis protokollen i henhold her kunne tjene som en værdifuld platform for screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af videnskab og teknologi Program af Zhuhai, Kina (grant nummer 20171009E030064), videnskab og teknologi Program af Guangdong, Kina (grant nummer 2015A020211004) og videnskab og teknologi Program af General Administration for kvalitetsovervågning, inspektion og karantæne i Folkerepublikken Kina (grant nummer 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

Immunologi og infektion sag 141 akut gastroenteritis, Salmonella spp. Shigella spp. screening real-time PCR guidet kultur
En høj overførselshastighed Platform for Screening af <em>Salmonella</em> spp. /<em>Shigella</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter