Чистый метод, основанный на плесень, создания эшафот бесплатный трехмерный сердечной ткани
Summary
Этот протокол описывает метод нетто на основе формы для создания трехмерных бесплатно эшафот сердечной ткани с удовлетворительным структурной целостности и поведение синхронное биений.
Abstract
Этот протокол описывает Роман и легко чистый метод на основе формы для создания трехмерной (3-D) сердечной ткани без дополнительных эшафот материала. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs), сердечной фибробластов (HCFs), человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) изолированные и используется для создания суспензии клеток с 70% iPSC-CMs, 15% HCFs и 15% HUVECs. Они совместно культивируемых в системе ультра-низким насадку «висит капля», которая содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время. Клетки агрегировать и спонтанно формируют избиение сфероидов после 3 дней совместного культуры. Сфероидов собирают, семенами в полости формы роман и культивировали в шейкер в инкубаторе. Сфероидов стать зрелой функциональные ткани примерно через 7 дней после посева. Результирующая многослойные ткани состоят из плавленого сфероидов с удовлетворительным структурной целостности и поведением синхронное биений. Этот новый метод имеет многообещающий потенциал воспроизводимость и экономически эффективным методом для создания инженерии тканей для лечения сердечной недостаточности в будущем.
Introduction
Цель текущего инженерии сердечной ткани является разработка терапии замены или ремонта структуры и функции пораженных тканей миокарда1. Методы для создания моделей 3-D сердечной ткани, экспонирование важные сократительной и электрофизиологические свойства родной сердечной ткани быстро расширяет2,3. Разнообразные стратегии были изучены и использованы в исследованиях4,5. Эти методы варьируются от использования конкретных синтетических и натуральных биоактивных гидрогели, например6желатин, коллаген, фибрина и пептиды, био чернил осаждения технологий2 и подложке технологии7.
Было показано, что леска бесплатные методы могут производить сопоставимые тканей как методы на основе биоматериала, без недостатков включения иностранных леса материала8. Орен Caspi et al. показали, что включение различных видов клеток позволяет поколения высоко васкуляризированной человеческой инженерии сердечной ткани9. Chin et al. разработали метод 3-D печати для создания сердца патч от сфероидов. Результате патчей состоят из кардиомиоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток в 70:15:15 соотношение10. Сфероидов было показано, чтобы быть эффективным «строительные блоки» бесплатно эшафот сердечной ткани творения, как они устойчивы к гипоксии и обладают достаточной механической целостности для имплантации11,12. Предыдущие исследования показали несколько методов изготовления для создания сфероида, включая использование висит drop метод, спиннер колбы13, microfluidic систем14и non сторонник культуры поверхностей без покрытия или с покрытием агарозы микро формы15. В этом протоколе, мы используем висит падение устройство, которое содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время.
Это исследование представляет собой Роман и эффективного эшафот, свободной метод для создания сердечной ткани, которая включает в себя вручную посева сфероидов в полости квадратные формы и инкубации ткани на шейкер для созревания. В условиях обычной статической культуры диффузия кислорода ограничивается внешние аспекты конструкции ткани, что приводит к центральной некроза. Однако с чистой формы, все сфероидов посеяны в плесень погружаются в СМИ с постоянной аэрогидродинамических движения, что позволяет для широкого распространения питательных веществ и кислорода. Кроме того этот метод на основе форм позволяет одновременное создание патчей тканей разного размера с минимальными усилиями ручной и результирующая ткань может быть легко удалена из формы. Этот новый метод позволяет для создания эффективной и воспроизводимые эшафот бесплатно, многослойные сердечной патчей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значение этого метода заключается в его воспроизводимости и эффективности результирующая многослойных сердечной ткани. В области инженерии сердечной ткани одна из целей текущей является определение метода для построения избиение, многослойных и функциональных 3-D сердца патчей. Мы п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают следующие источник финансирования: Фонд магии что вопросы для сердечно-сосудистых исследований.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
- Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
- Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
- Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
- Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163 (2016).
- Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
- Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566 (2017).
- Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
- Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
- Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
- Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
- Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
- Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
- Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
- Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).
