פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.
פרוטוקול זה מתאר של הרומן נטו מבוסס-עובש שיטה קלה ליצירת תלת-ממדיים (3-D) רקמות הלב ללא חומר נוסף לגרדום. Pluripotent אנושית-induced גזע-תא-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), fibroblasts הלב האנושי (HCFs), יפתור תאי אנדותל (HUVECs) הם מבודדים, המשמש ליצירת השעיה התא עם 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, ו- 15% HUVECs. . הם תרבותי משותף במערכת “התלויים טיפה” מצורף נמוך במיוחד, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת. התאים צבירה ויוצרים באופן ספונטני המכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות משותפת. Spheroids שנקטפו, נזרע לתוך החור עובש הרומן, תרבותי על מטרף בחממה. Spheroids להפוך רקמה תפקודית בוגרת כ 7 ימים לאחר זריעה. הרקמות מרובה שכבות הנובעת מורכב מאוחה spheroids עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני. שיטה חדשה זו יש פוטנציאל מבטיח כשיטה לשחזור וחסכונית ליצירת רקמות מהונדסים לטיפול באי ספיקת לב בעתיד.
המטרה של הנדסת רקמות הלב הנוכחית היא לפתח טיפול כדי להחליף או לתקן את המבנה והתפקוד של רקמת שריר הלב הפצוע1. שיטות ליצירת דגמים תלת-ממדיים ברקמת הלב מפגין המאפיינים כויץ ו אלקטרופיזיולוגיות חשוב של רקמת הלב יליד במהירות הרחבת2,3. מגוון רחב של אסטרטגיות חקר ומשמשת מחקרים4,5. אלה שיטות נע בין שימוש ספציפי טבעיים וסינתטיים ביו hydrogels, כגון ג’לטין, קולגן, פיברין, פפטידים6, ביו-דיו התצהיר טכנולוגיות2 ו- bioprinting טכנולוגיות7.
הוכח, כי שיטות לגרדום ללא יכול לייצר רקמות דומות כמו שיטות מבוססות biomaterial, ללא החסרונות של שילוב חומרים זרים פיגומים8. אורן כספי. et al. הוכיח כי שילוב של סוגים שונים של תאים מאפשרת את הדור של vascularized מאוד אנושי ברקמת הלב מהונדסים9. הסנטר. ואח פיתח שיטה הדפסה תלת-ממדי עבור יצירת תיקון הלב של spheroids. תיקונים וכתוצאה מכך הם מורכב cardiomyocytes fibroblasts, תאי אנדותל יחס 70:15:1510. Spheroids הוכחו להיות יעיל “אבני בניין” הבריאה ברקמת הלב ללא לגרדום, כפי שהם עמידים נגד היפוקסיה ושולט מספיק מכנית השרשה11,12. מחקרים קודמים הדגימו מספר שיטות ייצור ספרואיד הבריאה, כולל השימוש של התליה זרוק שיטה, טווה מבחנות13, microfluidic מערכות14, משטחים שאינם מחסידי תרבות מצופה עם או ללא ציפוי מיקרו-עובש agarose15. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים התליה טיפה התקן, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת.
מחקר זה מציג של הרומן ובאיזו שיטה לגרדום ללא יעיל הבריאה ברקמת הלב, אשר כולל זריעה ידנית את spheroids לתוך חור מרובע עובש המקננת הרקמה על מטרף עבור ההבשלה. בתנאים הרגילים תרבות סטטי, דיפוזיה חמצן מוגבלת להיבטים החיצוניים של הבונה רקמות, וכתוצאה מכך נמק במרכז. עם זאת, עם העובש נטו, כל spheroids נזרע לתבנית שקועים בתקשורת עם תנועה fluidic קבוע, המאפשר פעפוע מוגברת של חומרים מזינים וחמצן. בנוסף, שיטה זו מבוססת על עובש מתיר יצירת סימולטני של רקמות בגדלים שונים מדבקות במינימום מאמץ ידנית, הרקמה הנובעת ניתן להסיר בקלות התבנית. שיטה חדשנית זו מאפשרת יצירת לשחזור ויעילה של מדבקות לב נטולת לגרדום, מרובה שכבות.
המשמעות של שיטה זו נעוץ הפארמצבטית שלה ואת האפקטיביות של רקמת הלב הנובעת מרובה שכבות. בתחום של הנדסת רקמות הלב, אחת המטרות הנוכחית היא לזהות שיטה לבנות מכות מרובה שכבות, פונקציונלי תיקונים לב תלת-ממדי. . מדווחים שיטה לשחזור ויעילה של יצירת רקמות הלב מרובה שכבות על ידי זריעה ידנית ישירה של sph…
The authors have nothing to disclose.
המחברים להכיר את מקור המימון הבאים: קסם כי ענייני הקרן למחקר קרדיו.
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |