Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel
Summary
Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.
Abstract
Ce protocole décrit un procédé nouveau et facile net axée sur le moule pour créer des tissus cardiaques d’en trois dimensions (3d) sans matériel d’échafaudage supplémentaires. Cardiomyocytes de DERIVES de cellules-souches humaines pluripotentes (iPSC-CMs), les fibroblastes cardiaques humaines (CS) et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont isolées et utilisés pour générer une suspension de cellules avec 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs. Ils sont conjointement mis en culture dans un système de « goutte suspendue » de fixation ultra faible, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné. Les cellules agrègent et forment spontanément sphéroïdes de battement après 3 jours de culture mixte. Les sphéroïdes sont récoltés, ensemencées dans une cavité de moule roman et cultivées sur un agitateur dans l’incubateur. Les sphéroïdes devient un tissu fonctionnel mature environ 7 jours après le semis. Les tissus multicouches qui en résulte se composent des sphéroïdes fusionnés avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone. Cette nouvelle méthode a un potentiel prometteur comme une méthode reproductible et rentable de créer des tissus conçus pour le traitement de l’insuffisance cardiaque à l’avenir.
Introduction
Ingénierie de tissu cardiaque actuelle vise à développer une thérapie pour remplacer ou réparer la structure et la fonction du tissu myocardique lésée1. Méthodes pour créer des modèles 3D de tissu cardiaque présentant les propriétés contractiles et électrophysiologiques importantes du tissu cardiaque indigène ont rapidement étendu2,3. Diverses stratégies ont été exploré et utilisé dans les études4,5. Ces méthodes vont de l’utilisation des hydrogels bioactifs naturels et synthétiques spécifiques, comme la gélatine, le collagène, fibrine et peptides6, à la bio-encre dépôts technologies2 et bioprinting technologies7.
Il a été démontré que méthodes exempte d’échafaudage peuvent produire des tissus comparables comme les méthodes axées sur les biomatériaux, sans les inconvénients de l’incorporation de matière étrangère échafaudage8. Oren Caspi et coll. ont montré que l’incorporation de différents types de cellules active la génération de fortement vascularisé humain tissu cardiaque machiné9. Menton et coll. mis au point une méthode d’impression 3D pour la création de patch cardiaque de sphéroïdes. Correctifs qui en résultent sont composées des cardiomyocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales dans un ratio de 70:15:1510. Sphéroïdes ont démontré être efficaces « building blocks » de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage, comme ils résistent contre l’hypoxie et posséder une intégrité mécanique suffisante pour implantation11,12. Des études antérieures ont démontré plusieurs méthodes de fabrication pour la création de sphéroïde, y compris l’utilisation de la pendaison de glisser méthode, fileur flacons13, de systèmes microfluidiques14et les surfaces de culture non adhérents non couchés ni enduits avec d’agarose micro-moules15. Dans ce protocole, nous utilisons la pendaison goutte périphérique, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné.
Cette étude présente une nouvelle et efficace méthode sans échafaudage pour la création de tissu cardiaque, qui comprend l’ensemencement manuellement les sphéroïdes dans une cavité de moule carré et en incubant le tissu sur un agitateur pour la maturation. Dans des conditions de culture statique habituel, diffusion de l’oxygène est limitée aux aspects extérieurs de la construction des tissus, entraînant une nécrose centrale. Cependant, avec le moule net, tous les sphéroïdes ensemencées dans le moule sont immergés dans les médias avec un mouvement constant fluidique, permettant la diffusion accrue de nutriments et d’oxygène. En outre, cette méthode axée sur le moule permet la création simultanée de patchs de tissus de différentes tailles avec un minimum d’effort manuel et le tissu qui en résulte peut être facilement retiré du moule. Cette nouvelle méthode permet la création efficace et reproductible des patchs cardiaques sans échafaudage et multicouches.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’importance de cette méthode réside dans sa reproductibilité et l’efficacité du tissu cardiaque multicouche qui en résulte. Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, l’un des objectifs actuels est d’identifier une méthode pour construire les patchs cardiaques 3D battant, multicouches et fonctionnelles. Nous rapportons une méthode efficace et reproductible de création de plusieurs couches de tissus cardiaques par semis manuel direct des sphéroïdes composés des cardiomyocytes, cellules en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent la source de financement suivante : la magie que de questions Fonds recherche cardiovasculaire.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
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