Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco
Summary
Este protocolo descreve um método baseado em molde líquido para criar tecidos cardíacos livre de andaime tridimensionais com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono.
Abstract
Este protocolo descreve um romance e método baseado no molde líquido fácil criar tridimensional (3D) cardíaca os tecidos sem material adicional do andaime. Cardiomyocytes de tronco-derivado de células pluripotentes induzidas pelo homem (iPSC-CMs), fibroblastos cardíacos humanos (HCFs) e células endoteliais da veia umbilical humana (HX) são isoladas e usadas para gerar uma suspensão de células com 70% iPSC-CMs, HCFs 15% e 15% HX. Eles são co cultivados em um sistema de fixação ultra baixo “gota de suspensão” que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez. As células agregam e formam espontaneamente esferoides surra após 3 dias de co-cultura. Os esferoides são colhidas, semeados em uma cavidade do molde de romance e cultivadas num agitador na incubadora. Os esferoides tornar-se um tecido maduro funcional, aproximadamente 7 dias após a semeadura. Os tecidos resultantes de várias camados consistem de esferoides fundidos com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono. Este novo método tem um potencial promissor como um método reprodutível e de baixo custo para criar tecidos projetados para o tratamento da insuficiência cardíaca no futuro.
Introduction
O objetivo da engenharia de tecido cardíaco atual é desenvolver uma terapia para substituir ou reparar a estrutura e função do tecido lesado do miocárdio1. Métodos para criar modelos 3D de tecido cardíaco, exibindo as propriedades contráteis e eletrofisiológicas importantes do tecido cardíaco nativo tem sido rápida expansão2,3. Uma variedade de estratégias foram explorados e utilizados em estudos de4,5. Esses métodos variam o uso do específico hidrogel bioativos naturais e sintéticas, tais como gelatina, colágeno, fibrina e peptídeos6, a bio-tinta deposição tecnologias2 e bioprinting tecnologias7.
Ficou demonstrado que métodos livre de andaime podem produzir tecidos comparáveis como métodos baseados em biomateriais, sem os inconvenientes de incorporação de material estrangeiro andaimes8. Oren Caspi et al demonstraram que a incorporação de vários tipos de células permite a geração de tecido cardíaco engenharia humano altamente vascularizado9. Chin et al desenvolveram um método de impressão 3D para criação de remendo cardíaca de esferoides. Resultante de patches são compostas de cardiomyocytes, fibroblastos e células endoteliais em uma relação de 70:15:1510. Esferoides foram mostrados para ser eficazes “blocos de construção” da criação de tecido cardíaco andaime-livre, como eles são resistentes contra hipóxia e possuem integridade mecânica suficiente para implantação de11,12. Estudos anteriores têm demonstrado vários métodos de fabricação para criação de esferoide, incluindo o uso do enforcamento soltar método, girador frascos13, microfluidic sistemas14e superfícies não-aderente cultura não revestidos ou revestidos com micromoldes de agarose15. Neste protocolo, usamos o enforcamento gota dispositivo, que contém microporos para centenas de esferoides de condensação de uma só vez.
Este estudo apresenta uma nova e eficiente método de andaime-livre para a criação de tecido cardíaco, que inclui a semeadura manualmente os esferoides em uma cavidade do molde quadrado e incubando o tecido num agitador para maturação. Em condições habituais de cultura estática, difusão de oxigênio é limitada aos aspectos exteriores da construção de tecido, resultando em necrose central. No entanto, com o molde líquido, todos os esferoides semeados no molde estão imersos na mídia com um constante movimento fluídico, permitindo a maior difusão de nutrientes e oxigênio. Além disso, este método baseado em molde permite a criação simultânea de patches de tecido de diferentes tamanhos, com o mínimo de esforço manual e o tecido resultante pode ser facilmente removido do molde. Este novo método permite a criação eficiente e reprodutível de patches cardíacas andaime-livre, em várias camadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O significado deste método reside na sua reprodutibilidade e a eficácia do tecido cardíaco resultante em várias camadas. No campo da engenharia de tecido cardíaco, uma das metas do atuais é identificar um método para construir batendo, várias camadas e funcionais patches cardíacas em 3D. Nós relatamos um método eficiente e reprodutível de criação de várias camadas de tecidos cardíacos por sementeira directa manual de esferoides compostas de fibroblastos, células endoteliais e cardiomyocytes num romance m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o seguinte fonte de financiamento: o fundo magia que questões de investigação Cardiovascular.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
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