أسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثي الأبعاد
Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب المستندة إلى القالب صافي لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثية الأبعاد مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول الرواية وسهلة الأسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء ثلاثية الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) أنسجة القلب دون مواد إضافية سقالة. وتعزل cardiomyocytes المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان (اللجنة التوجيهية-المهاجرة) والليفية القلب البشري (هكفس)، والخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس) وتستخدم لتوليد تعليق خلية مع 70% اللجنة التوجيهية-المهاجرة، هكفس 15%، و 15% هوفيكس. أنها تربى اشتركت في نظام “قطره معلقة” مرفق منخفضة للغاية، الذي يحتوي على ميكروبوريس للتكثيف مئات الماغنيسيوم في وقت واحد. تجميع الخلايا وتشكل الماغنيسيوم الضرب تلقائياً بعد 3 أيام ثقافة المشارك. الماغنيسيوم تحصد، المصنفة في تجويف قالب رواية، ومثقف في شاكر في الحاضنة. الماغنيسيوم تصبح أنسجة فنية ناضجة حوالي 7 أيام بعد البذر. الأنسجة المتعددة الطبقات الناتجة تتألف من الماغنيسيوم تنصهر مع السلامة الهيكلية مرضية وسلوك الضرب متزامن. هذا الأسلوب الجديد إمكانات واعدة كأسلوب استنساخه وفعالة من حيث التكلفة لإنشاء هندسة الأنسجة لعلاج فشل القلب في المستقبل.
Introduction
هندسة الأنسجة القلبية الحالي يهدف إلى تطوير علاج لاستبدال أو إصلاح هيكل ووظيفة النسيج المصاب احتشاء عضلة القلب1. طرق لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد من أنسجة القلب نستعرض خصائص الهوس والكهربية الهامة من أنسجة القلب الأصلي وقد تم التوسع بسرعة2،3. تم استكشاف مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات والمستخدمة في الدراسات4،5. أساليب تتراوح هذه استخدام محددة الاصطناعية والطبيعية النشطة بيولوجيا الهلاميات المائية، مثل الببتيدات وفيبرينوجين، الجيلاتين والكولاجين6، تقنيات الترسيب بيو-حبر2 وبيوبرينتينج التكنولوجيات7.
لقد ثبت أن أساليب خالية من سقالة يمكن أن تنتج أنسجة قابلة للمقارنة كالطرق على أساس مادة بيولوجية، دون عيوب إدراج مواد السقالات الخارجية8. كاسبي أورين et al. أثبت أن دمج أنواع مختلفة من الخلايا يمكن توليد عالية vascularized أنسجة القلب هندسيا البشرية9. الذقن وآخرون وضع طريقة طباعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء تصحيح القلب من الماغنيسيوم. تتألف البقع الناتجة من cardiomyocytes، والخلايا الليفية، وخلايا بطانية في 70:15:15 نسبة10. الماغنيسيوم قد ثبت أن تكون فعالة “لبنات” لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة، كما أنها تقاوم ضد نقص وتمتلك سلامة ميكانيكية كافية لغرس11،12. أظهرت الدراسات السابقة تلفيق العديد من الطرق لإنشاء كروي، بما في ذلك استخدام المعلقة إسقاط غزل قوارير13وموائع جزيئية نظم14، الأسلوب والأسطح غير ملتصقة الثقافة غير المصقول أو المطلي مع [اغروس] قوالب الصغيرة15. في هذا البروتوكول، نستخدم معلقة جهاز الإسقاط، الذي يحتوي على ميكروبوريس للتكثيف مئات الماغنيسيوم في وقت واحد.
تقدم هذه الدراسة الرواية والأسلوب كفاءة خالية من السقالة لإنشاء أنسجة القلب، والتي تشمل البذر يدوياً الماغنيسيوم في تجويف قالب مربعة وتفرخ الأنسجة على شاكر للنضج. نشر الأوكسجين تحت ظروف الثقافة الثابتة المعتادة، ويقتصر على الجوانب الخارجية لبناء الأنسجة، أسفر عن نخر المركزية. ومع ذلك، مع الصافي العفن، مغمورة جميع الماغنيسيوم تبذر في القالب في وسائل الإعلام مع حركة فلويديك مستمرة، مما يسمح لزيادة نشر المواد المغذية والأكسجين. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب القائم على العفن يسمح بإنشاء متزامنة من بقع الأنسجة مختلفة الأحجام مع الحد الأدنى من الجهد اليدوي، ويمكن بسهولة إزالة الأنسجة الناتجة من العفن. يسمح هذا الأسلوب رواية لإنشاء كفاءة واستنساخه من بقع القلب خالية من السقالة، متعدد الطبقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتكمن أهمية هذا الأسلوب في إمكانية تكرار نتائج وفعالية الأنسجة القلبية الطبقات الناتجة. في مجال هندسة الأنسجة القلبية، أحد الأهداف الحالية لتحديد أسلوب لبناء بقع القلب ثلاثي الأبعاد الضرب، والطبقات، والوظيفية. ونحن التقرير وسيلة كفؤة واستنساخه لإنشاء أنسجة القلب متعدد الطبقات بالبذر ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يعترف مصدر التمويل التالية: “السحر أن الصندوق المسائل” “أبحاث القلب والأوعية الدموية”.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
- Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
- Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
- Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
- Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163 (2016).
- Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
- Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566 (2017).
- Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
- Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
- Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
- Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
- Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
- Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
- Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
- Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).
