Det här protokollet beskriver en netto mögel-baserad metod för att skapa tredimensionella byggnadsställning-fri hjärt vävnader med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende.
Det här protokollet beskriver en ny och enkel netto mögel-baserad metod för att skapa tredimensionella (3D) hjärtats vävnader utan ytterligare byggnadsställning material. Människans pluripotenta stamceller-cell-derived hjärtmuskelcellerna (iPSC-CMs), mänskliga hjärt fibroblaster (HCF) och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) har isolerats och används för att generera en cellsuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs. De är tillsammans odlade i en extremt låg ”hängande droppe” fästsystem, som innehåller mikroporer för kondenserande hundratals spheroids i taget. Cellerna aggregerade och bilda spontant stryk spheroids efter 3 dagar av samtidig kultur. Spheroids skördas, seedade i en roman mögel hålighet och odlade på en shaker i inkubatorn. Spheroids blivit en mogen funktionell vävnad cirka 7 dagar efter sådd. De resulterande multilayered vävnaderna består av smält spheroids med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende. Denna nya metod har lovande potential som en reproducerbar och kostnadseffektiv metod för att skapa bakåtkompilerade vävnader för behandling av hjärtsvikt i framtiden.
Syftet med aktuell hjärt vävnadsteknik är att utveckla en terapi för att ersätta eller reparera struktur och funktion av skadade hjärtinfarkt vävnad1. Metoder för att skapa 3D-hjärtvävnad modeller uppvisar infödda hjärtvävnad viktigt kontraktila och elektrofysiologiska egenskaper har expanderat snabbt2,3. Olika strategier har utforskats och används i studier4,5. Dessa sträcker sig från användningen av särskilda syntetiska och naturliga bioaktiva hydrogels, såsom gelatin, kollagen, fibrin och peptider6, till bio-bläck nedfall teknik2 och bioprinting teknik7.
Det har visats att byggnadsställning-fria metoder kan producera jämförbara vävnader som biomaterial-baserade metoder, utan nackdelarna med införliva utländska byggnadsställningar materiella8. Oren Caspi et al. visade att införlivandet av olika typer av celler möjliggör generering av högt vaskulariserad mänskliga bakåtkompilerade hjärtvävnad9. Hakan et al. utvecklat en 3D-utskrift metod för hjärt patch skapelse från spheroids. Resulterande fläckar består av hjärtmuskelceller, fibroblaster och endotelceller i ett 70:15:15 baserat på10. Spheroids har visat sig vara effektiva ”byggstenar” av byggnadsställning-fri hjärtvävnad skapelse, eftersom de är resistenta mot hypoxi och besitter tillräcklig mekanisk integritet för implantation11,12. Tidigare studier har visat flera framställningsmetoder för sfäroid skapande, inklusive användning av hängande släpp metoden, spinner kolvar13, ultrakalla system14och icke-anhängare kultur ytor olackerad eller lackerad med agaros mikro-formar15. I detta protokoll, vi använder hängande droppe enhet, som innehåller mikroporer för kondenserande hundratals spheroids i taget.
Denna studie presenterar en ny och effektiv byggnadsställning-fri metod för hjärtvävnad skapelse, som inkluderar manuellt sådd spheroids i en fyrkantig mögel hålighet och ruvning vävnaden på en shaker för mognad. Under vanliga statiska odlingsbetingelser är syre diffusion begränsad till de yttersta aspekterna av den vävnad bygga, vilket resulterar i central nekros. Dock med netto mögel, är alla de spheroids seedade i formen nedsänkta i media med en ständig fluidic rörelse, vilket möjliggör ökad diffusion av näringsämnen och syre. Dessutom detta mögel-baserad metod möjliggör samtidiga skapandet av olika storlek vävnad fläckar med minimal manuellt arbete och den resulterande vävnaden kan enkelt tas ur formen. Denna nya metod möjliggör effektiv och reproducerbara skapandet av byggnadsställning-fri, multilayered hjärt patchar.
Betydelsen av denna metod ligger i dess reproducerbarhet och effektiviteten av den resulterande multilayered hjärtvävnad. I fältet för hjärt vävnadsteknik är en av de nuvarande mål att identifiera en metod för att konstruera klappande, mångbottnad och funktionell 3D-hjärt patchar. Vi rapporterar en effektiv och reproducerbar metod att skapa multilayered hjärt vävnader genom manuell direktsådd av spheroids består av hjärtmuskelceller, endotelceller och fibroblaster i en roman netto mögel. Den netto mögel…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner följande finansiering källa: Magic att frågor fonden för kardiovaskulär forskning.
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |