Kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo
Summary
Eiwitsynthese is een kritisch biologisch proces voor cellen. In de hersenen is het vereist voor adaptieve wijzigingen. Meting van de tarieven van de eiwitsynthese in de intacte hersenen vereist zorgvuldige methodologische overwegingen. Hier presenteren we de L-[1-14C]-Leucine kwantitatieve autoradiografische methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese in vivo.
Abstract
Eiwitsynthese is nodig voor de ontwikkeling en het onderhoud van de neuronale functie en is betrokken bij adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel. Bovendien wordt gedacht dat disregulatie van de eiwitsynthese in het zenuwstelsel een kern fenotype in sommige ontwikkelingsstoornissen kan zijn. Nauwkeurige meting van de tarieven van cerebrale eiwitsynthese in diermodellen is belangrijk voor het begrijpen van deze aandoeningen. De methode die we hebben ontwikkeld is ontworpen om te worden toegepast op de studie van wakker, gedragen dieren. Het is een kwantitatieve autoradiografische methode, zodat het tarieven in alle regio’s van de hersenen tegelijkertijd kan opleveren. De methode is gebaseerd op het gebruik van een Tracer aminozuur, L-[1-14C]-Leucine, en een kinetische model van het gedrag van L-leucine in de hersenen. We kozen voor L-[1-14C]-Leucine als de Tracer omdat het niet leidt tot vreemd gelabelde stofwisselingsproducten. Het is ofwel opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot opbrengst 14co2 die wordt verdund in een grote pool van niet-gelabelde co2 in de hersenen. De methode en het model zorgen ook voor de bijdrage van niet-gelabelde Leucine afgeleid van weefsel proteolyse aan de weefsel precursor pool voor eiwitsynthese. De methode heeft de ruimtelijke resolutie om te bepalen van de eiwitsynthese percentages in cel en neuro pil lagen, evenals hypothalame en craniale zenuw kernen. Om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om te voldoen aan procedurele details. Hier presenteren we de gedetailleerde procedures van de kwantitatieve autoradiographic L-[1-14C]-Leucine methode voor de bepaling van de regionale percentages van de eiwitsynthese in vivo.
Introduction
Eiwitsynthese is een belangrijk biologisch proces dat nodig is voor lange termijn adaptieve veranderingen in het zenuwstelsel1. Remming van de eiwitsynthese blokkeert lange termijn geheugen opslag in zowel ongewervelde dieren en gewervelde dieren2. Eiwitsynthese is essentieel voor het onderhoud van de late fasen van sommige vormen van lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD)3, neuronale overleving tijdens ontwikkeling4, en voor algemeen onderhoud van het neuron en zijn synaptische verbindingen5. Meting van de tarieven van de hersenen eiwitsynthese kan een belangrijk instrument waarmee te studeren adaptieve veranderingen evenals neuroontwikkelingsstoornissen en aandoeningen met betrekking tot leren en geheugen.
We hebben een methode ontwikkeld om de percentages van de cerebrale eiwitsynthese in vivo te kwantificeren in een wakker dier dat inherente voordelen biedt ten opzichte van andere technieken die de percentages in ex vivo of in vitro preparaten van hersenweefsel6inschatten. De belangrijkste is de toepasbaarheid op metingen in het intacte brein in een wakker dier. Dit is een belangrijke overweging, omdat het toelaat metingen met synaptische structuur en functie op zijn plaats en zonder zorgen over post mortem effecten. Bovendien bereikt de kwantitatieve autoradiografische benadering die wij hanteren een hoge mate van ruimtelijke lokalisatie. Overwegende dat de energie van 14C zodanig is dat we de Tracer niet op het subcellulaire of cellulaire niveau kunnen lokaliseren, we kunnen de tarieven in cellagen en kleine hersengebieden zoals hypothalamische kernen meten, met ongeveer een 25 μm-resolutie7.
Een uitdaging van in vivo metingen met radiotracers is om ervoor te zorgen dat radio label gemeten is in het product van de reactie van belang in plaats van ongereageerde gelabelde precursor of ander vreemd gelabelde metabole producten6. We kozen voor L-[1-14C]-Leucine als de Tracer aminozuur omdat het ofwel is opgenomen in eiwitten of snel gemetaboliseerd tot 14co2, die wordt verdund in de grote pool van niet-gelabelde co2 in de hersenen als gevolg van de hoge snelheid van energiemetabolisme8. Bovendien bestaat 14c niet opgenomen in eiwitten voornamelijk als vrij [14c]-Leucine, die gedurende de experimentele periode van 60 minuten bijna volledig uit het weefsel6wordt geklaard. Eiwitten worden vervolgens vastgemaakt aan weefsel met formaline en vervolgens gespoeld met waterom elke vrije [14C]-Leucine te verwijderen voor autoradiografie.
Een andere belangrijke overweging is de kwestie van de verdunning van de specifieke activiteit van de precursor aminozuur pool door niet-gelabelde aminozuren afgeleid van weefsel proteolyse. We hebben aangetoond dat bij volwassen rat en muis, ongeveer 40% van de precursor Leucine pool voor eiwitsynthese in de hersenen komt uit aminozuren afgeleid van eiwitafbraak6. Dit moet worden opgenomen in de berekening van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp’s) en moet worden bevestigd in studies waarin deze relatie kan veranderen. De theoretische basis en de veronderstellingen van de methode zijn in detail elders gepresenteerd6. In dit document richten we ons op de procedurele kwesties van de toepassing van deze methodologie.
Deze methode is gebruikt voor de bepaling van de rcp’s in de grondeekhoorns9, schapen10, rhesus monkeys11, ratten12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, een muismodel van het Tubereuze sclerosecomplex 22, een muismodel van fragiel x-syndroom23,24,25,26, fragiele x premutatie muizen27, en een muismodel van fenylketonurie28. In dit manuscript presenteren we de procedures voor het meten van Rcp’s met de in vivo autoradiographic L-[1-14C]-Leucine-methode. We presenteren Rcp’s in hersengebieden van een wakker besturings muis. We tonen ook aan dat in vivo toediening van anisomycine, een remmer van de vertaling, afschaffing van de eiwitsynthese in de hersenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een kwantitatieve methode voor de bepaling van de regionale tarieven van cerebrale eiwitsynthese (Rcp’s) in vivo bij proefdieren. Deze methode heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden: 1. metingen worden gedaan in het wakker gedragen dier, dus ze weerspiegelen de lopende processen in de werkende hersenen. 2. metingen worden gedaan door middel van kwantitatieve autoradiografie die de mogelijkheid om te bepalen van de Rcp’s in alle regio’s en subregio’s van de hersenen tegelijkertijd….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Zengyan Xia graag erkennen voor de genotypering van de muizen, Tom Burlin voor de verwerking van aminozuren en films, en mei Qin voor het uitvoeren van enkele van de rCPS experimenten. Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het NIMH, ZIA MH00889. RMS werd ook gesteund door een Autisme spreekt Postdoctoral Fellowship 8679 en een FRAXA postdoctorale Fellowship.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
Referências
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
