Método autoradiográfico cuantitativo para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in Vivo
Summary
La síntesis de proteínas es un proceso biológico crítico para las células. En el cerebro, es necesario para los cambios adaptativos. La medición de las tasas de síntesis de proteínas en el cerebro intacto requiere consideraciones metodológicas cuidadosas. Aquí presentamos el método autoradiográfico cuantitativo L-[1-14C]-leucina para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales in vivo.
Abstract
La síntesis de proteínas es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de la función neuronal y participa en cambios adaptativos en el sistema nervioso. Por otra parte, se cree que la desregulación de la síntesis de proteínas en el sistema nervioso puede ser un fenotipo principal en algunos trastornos del desarrollo. La medición precisa de las tasas de síntesis de proteínas cerebrales en modelos animales es importante para comprender estos trastornos. El método que hemos desarrollado fue diseñado para ser aplicado al estudio de los animales despiertos y comportándose. Es un método autoradiográfico cuantitativo, por lo que puede producir tasas en todas las regiones del cerebro simultáneamente. El método se basa en el uso de un aminoácido trazador, L-[1-14C]-leucina, y un modelo cinético del comportamiento de la L-leucina en el cerebro. Elegimos L-[1-14C]-leucina como el trazador porque no conduce a productos metabólicos etiquetados ajenos. Se incorpora a la proteína o se metaboliza rápidamente para producir 14CO2 que se diluye en un gran grupo de CO2 sin etiquetar en el cerebro. El método y el modelo también permiten la contribución de leucina sin etiquetar derivada de la proteólisis tisular a la piscina precursora de tejido para la síntesis de proteínas. El método tiene la resolución espacial para determinar las tasas de síntesis de proteínas en las capas celulares y neuropil, así como los núcleos nerviosos hipotalámicos y craneales. Para obtener datos cuantitativos fiables y reproducibles, es importante seguir los detalles de procedimiento. Aquí presentamos los procedimientos detallados del método cuantitativo autoradiográfico L-[1-14C]-leucina para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas in vivo.
Introduction
La síntesis de proteínas es un proceso biológico importante necesario para el cambio adaptativo a largo plazo en el sistema nervioso1. La inhibición de la síntesis de proteínas bloquea el almacenamiento de memoria a largo plazo tanto en invertebrados comoptvertebrados 2. La síntesis de proteínas es esencial para el mantenimiento de las fases finales de algunas formas de potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD)3, supervivencia neuronal durante el desarrollo4, y para el mantenimiento general de la neurona y su conexiones sinápticas5. La medición de las tasas de síntesis de proteínas cerebrales puede ser una herramienta importante con la que estudiar los cambios adaptativos, así como los trastornos y trastornos del neurodesarrollo relacionados con el aprendizaje y la memoria.
Hemos desarrollado un método para cuantificar las tasas de síntesis de proteínas cerebrales in vivo en un animaldespierto que ofrece ventajas inherentes sobre otras técnicas que estiman las tasas en preparaciones ex vivo o in vitro del tejido cerebral 6. Lo más importante es la aplicabilidad a las mediciones en el cerebro intacto en un animal despierto. Esta es una consideración clave porque permite mediciones con estructura sináptica y función en su lugar y sin preocupaciones sobre los efectos post mortem. Además, el enfoque autoradiográfico cuantitativo que empleamos logra un alto grado de localización espacial. Mientras que la energía de 14C es tal que no podemos localizar el trazador a nivel subcelular o celular, podemos medir las tasas en capas celulares y pequeñas regiones cerebrales como núcleos hipotalámicos, con aproximadamente una resolución de 25 m7.
Uno de los desafíos de las mediciones in vivo con radiosondas es garantizar que la radioetiqueta medida esté en el producto de la reacción de interés en lugar de precursores etiquetados no reaccionados u otros productos metabólicos etiquetados extraños6. Elegimos L-[1-14C]-leucina como el aminoácido trazador porque se incorpora a la proteína o se metaboliza rápidamente a 14CO2, que se diluye en la gran piscina de CO2 sin etiquetar en el cerebro resultante de la alta tasa de metabolismo energético8. Por otra parte, cualquier 14C no incorporado en la proteína existe principalmente como libre [14C]-leucina, que durante el período experimental de 60 minutos, se elimina casi en su totalidad del tejido6. Las proteínas se fijan a tejido con formalina y posteriormente se enjuagan con agua para eliminar cualquier libre [14C]-leucina antes de la autoradiografía.
Otra consideración importante es la cuestión de la dilución de la actividad específica de la piscina de aminoácidos precursores por aminoácidos sin etiquetar derivados de la proteólisis tisular. Hemos demostrado que en ratas y ratones adultos, alrededor del 40% de la piscina de leucina precursora para la síntesis de proteínas en el cerebro proviene de aminoácidos derivados de la descomposición de proteínas6. Esto debe incluirse en el cálculo de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales (rCPS) y debe confirmarse en estudios en los que esta relación puede cambiar. La base teórica y los supuestos del método sehan presentado en detalle en otros lugares 6. En este documento, nos centramos en las cuestiones de procedimiento de la aplicación de esta metodología.
Este método se ha empleado para la determinación de rCPS en ardillas molidas9, ovejas10, monos rhesus11, ratas12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, un modelo de ratón de Complejo de Esclerosis Tuberosa22,un modelo de ratón de síndrome X frágil23,24,25,26, frágil esratones de premutación X27,y un ratón modelo de fenilcetonuria28. En este manuscrito, presentamos los procedimientos para la medición de rCPS con el método autoradiográfico in vivo L-[1-14C]-leucina. Presentamos rCPS en las regiones cerebrales de un ratón de control despierto. También demostramos que la administración in vivo de anisomicina, un inhibidor de la traducción, abolió la síntesis de proteínas en el cerebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos un método cuantitativo para la determinación de las tasas regionales de síntesis de proteínas cerebrales (rCPS) in vivo en animales experimentales. Este método tiene ventajas considerables sobre los métodos existentes: 1. Las mediciones se realizan en el animal que se comporta despierto, por lo que reflejan los procesos en curso en el cerebro en funcionamiento. 2. Las mediciones se realizan por medio de la autoradiografía cuantitativa que permite determinar el RCPS en todas las regiones y subregiones d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren reconocer a Zengyan Xia por el genotipado de los ratones, Tom Burlin para el procesamiento de aminoácidos y películas, y Mei Qin por realizar algunos de los experimentos de rCPS. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del NIMH, ZIA MH00889. RMS también fue apoyado por una beca postdoctoral Autism Speaks 8679 y una beca postdoctoral FRAXA.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
Referências
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