השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo
Summary
סינתזה חלבונים היא תהליך ביולוגי קריטי עבור תאים. במוח, זה נדרש עבור שינויים גמישים. מדידת שיעורי סינתזה של חלבון במוח שלמה מחייבת שיקולים מתודולוגיים זהירים. כאן אנו מציגים את L-[1-14ג]-השיטה האוטומטית לאוצין כמותי לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בvivo.
Abstract
סינתזה חלבון נדרש לפיתוח ותחזוקה של תפקוד עצבי והוא מעורב שינויים גמישים במערכת העצבים. יתר על כן, הוא חשב כי דיסתקנה של סינתזה חלבון במערכת העצבים עשוי להיות פנוטיפ ליבה בכמה הפרעות התפתחותיות. מדידה מדויקת של שיעורי סינתזה חלבון מוחין במודלים בעלי חיים חשוב להבנת הפרעות אלה. השיטה שפיתחנו תוכננה להיות מיושמת על חקר בעלי חיים מתעוררים ומתנהגים. זוהי שיטת אדיקסוגרפית כמותית, כך שהיא יכולה להניב שיעורי בכל אזורי המוח בו זמנית. השיטה מבוססת על שימוש בחומצת אמינו מנותב, L-[1-14ג]-לאוצין, ודגם קינטי של התנהגות ה-L-לאוצין במוח. בחרנו L-[1-14ג]-לאוצין כעוקב כי זה לא מוביל למוצרי חילוף חומרים חיצוניים עם תוויות. הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי להניב 14CO2 אשר מדולל בבריכה גדולה של ושות בלתי מתויג2 במוח. השיטה ואת המודל גם לאפשר את התרומה של לאוצין בלתי מסומן נגזר רקמות פרוטפוליזיס של רקמת הבריכה מקודע לסינתזה חלבון. השיטה יש את הרזולוציה המרחבית כדי לקבוע את שיעורי סינתזה החלבון בתא ושכבות נוירופיל, כמו גם היפותלמי וגרעיני עצבי הגולגולת. כדי לקבל נתונים כמותיים אמין ולאחר, חשוב לדבוק בפרטים פרוצדורליים. כאן אנו מציגים את ההליכים המפורטים של השיטה האוטומטית הכמותית-[1-14ג]-שיטת לאוצין לקביעת שיעורי הסינתזה של החלבון בvivo.
Introduction
סינתזה חלבון הוא תהליך ביולוגי חשוב הנדרש עבור שינוי לטווח ארוך מסתגלת במערכת העצבים1. מעכב הסינתזה של חלבון חוסם לטווח ארוך אחסון זיכרון בשני חסרי חוליות ובעלי חוליות2. סינתזה של חלבון היא חיונית לתחזוקת השלבים המאוחרים של כמה צורות של הפוטנציאל לטווח ארוך (ltp) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ)3, הישרדות עצבית במהלך פיתוח4, ולתחזוקה כללית של העצב וה חיבורים סינפטית5. מדידה של שיעורי סינתזה חלבון המוח עשוי להיות כלי חשוב שבו ללמוד שינויים גמישים, כמו גם הפרעות נוירותפתחותיות והפרעות הקשורות ללמידה וזיכרון.
פיתחנו שיטה לכמת שיעורי סינתזה חלבון מוחין בvivo בחיה ערה המציעה יתרונות הטבועות על פני טכניקות אחרות הערכת שיעורי vivo ex או ההכנות מחוץ לבית של רקמת המוח6. בראש ובראשונה, תחולתה למדידות במוח השלם בבעל חיים ער. זהו שיקול מפתח כי זה מאפשר מדידות עם מבנה סינפטית תפקוד במקום וללא חששות לאחר השפעות לאחר המוות. כמו-כן, הגישה האוטומטית הכמותית שאנו מעסיקים משיגה מידה גבוהה של לוקליזציה מרחבית. בעוד האנרגיה של 14ג הוא כזה שאנחנו לא יכולים להתאים את מכשיר המעקב ברמה subcellular או הסלולר, אנחנו יכולים למדוד את התעריפים בשכבות התא ואזורי מוח קטנים כגון גרעיני היפותלמי, עם בערך 25 יקרומטר רזולוציה7.
אתגר אחד של מדידות vivo עם רדיומשדרים היא להבטיח כי radiolabel נמדד הוא במוצר של תגובת הריבית ולא הגיבו מקודדד או מוצרים אחרים מטבולית המסומנים בתווית6. בחרנו L-[1-14ג]-leucine כמו חומצת אמינו מעקב כי הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי 14CO2, אשר מדולל בבריכה גדולה של שיתוף בלתי מתויג2 במוח כתוצאה משיעור גבוה של חילוף חומרים אנרגיה8. יתר על כן, כל 14ג ‘ לא משולבים לחלבון קיים בעיקר בחינם [14ג]-leucine, אשר במשך התקופה 60 min ניסיוני, הוא כמעט לחלוטין נקי מן הרקמה6. חלבונים הם לאחר מכן מקובעים רקמה עם פורמלין ולאחר מכן שטף עם מים כדי להסיר כל חינם [14ג]-לאוצין לפני האדיגרפיה האוטומטית.
שיקול חשוב נוסף הוא הנושא של דילול הפעילות הספציפית של בריכת חומצת אמינו מקודמת על ידי חומצות אמינו ללא תווית הנגזרות רקמות פרוטפוליזיס. הצגנו כי בעכברוש מבוגר עכבר, על 40% של בריכת לאוצין מקודמן לסינתזה חלבון במוח מגיע חומצות אמינו נגזר התמוטטות חלבונים6. זה חייב להיות כלול בחישוב של שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) ויש לאשר במחקרים שבהם קשר זה עשוי להשתנות. הבסיס התיאורטי וההנחות של השיטה הוצגו בפרוטרוט במקומות אחרים6. במאמר זה, נתמקד בסוגיות הפרוצדוראליות של יישום מתודולוגיה זו.
שיטה זו הועסק לקביעת rcps בסנאים הקרקע9, כבשים10, רזוס קופים11, חולדות12,13,14,15,16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 21, מודל העכבר של מורכב טרשת מורכבת22, מודל עכבר של תסמונת X שביר23,24,25,26, שברירי X עכברים מוטציה27, ו מ העכבר דגם של פנילקטונוריה28. בכתב יד זה, אנו מציגים את ההליכים למדידה של Rssl עם vivo האוטומטי-[1-14ג]-שיטת הלוצין. אנו מציגים את השוכרים באזורי. המוח של עכבר שליטה ער אנו גם להדגים כי בניהול vivo של anisomycin, מעכב של תרגום, ביטול סינתזה חלבון במוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים שיטה כמותית לקביעת שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) בvivo בבעלי חיים ניסיוניים. לשיטה זו יתרונות ניכרים בשיטות הקיימות: 1. מדידות מועצמות בחיה המתתעוררת, ולכן הן משקפות תהליכים מתמשכים במוח התפקודי. 2. מדידות מושמעות באמצעות כמותי אוטומטי מאפשר את היכולת לקבוע rCPS בכל האזורים…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר Zengyan Xia עבור הגנוזה של העכברים, טום בורלין לעיבוד של חומצות אמינו וסרטים, מיי צ’ין לביצוע כמה ניסויים rCPS. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר תוך-ציור של NIMH, ZIA MH00889. RMS גם נתמך על ידי אוטיזם מדבר המענק 8679 ו המענק FRAXA פוסט דוקטורט.
Materials
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8×10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
Referências
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
