Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

Summary

A síntese proteica é um processo biológico crítico para as células. No cérebro, é necessário para mudanças adaptativas. A mensuração das taxas de síntese proteica no cérebro intacto requer considerações metodológicas cuidadosas. Aqui nós apresentamos o L-[1-¹⁴C]-método Bakersfield quantitativo da leucina para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral in vivo.

Abstract

A síntese protéica é necessária para o desenvolvimento e manutenção da função neuronal e está envolvida em mudanças adaptativas no sistema nervoso. Além disso, pensa-se que o desregulação da síntese da proteína no sistema nervoso pode ser um phenotype do núcleo em algumas desordens desenvolventes. A medida exata das taxas da síntese da proteína cerebral em modelos animais é importante para compreender estas desordens. O método que desenvolvemos foi projetado para ser aplicado ao estudo de animais acordados e comportados. É um método autoradiográfico quantitativo, de modo que pode render taxas em todas as regiões do cérebro simultaneamente. O método é baseado no uso de um aminoácido traçador, L-[1-¹⁴C]-leucina, e um modelo cinético do comportamento da L-leucina no cérebro. Nós escolhemos L-[1-¹⁴C]-leucina como o Tracer porque não conduz aos produtos metabólicos etiquetados estranhos. É incorporado na proteína ou metabolizado ràpida para render ¹⁴co₂ que é diluído em uma grande associação de co₂ sem rótulo no cérebro. O método e o modelo também permitem a contribuição da leucina sem rótulo derivada da proteólise tecidual para a associação precursora do tecido para síntese proteica. O método tem a resolução espacial para determinar as taxas de síntese protéica em camadas de células e neurópilo, bem como núcleos hipotalâmicos e do nervo craniano. Para obter dados quantitativos confiáveis e reprodutíveis, é importante aderir aos detalhes processuais. Aqui apresentamos os procedimentos detalhados do método quantitativo autoradiográfico L-[1-¹⁴C]-leucina para a determinação das taxas regionais de síntese protéica in vivo.

Introduction

A síntese proteica é um importante processo biológico necessário para a mudança adaptativa de longo prazo no sistema nervoso¹. A inibição da síntese proteica bloqueia o armazenamento de memória de longo prazo em invertebrados e vertebrados². A síntese proteica é essencial para a manutenção das fases tardias de algumas formas de potenciação a longo prazo (LTP) e depressão a longo prazo (Ltd)³, sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento⁴, e para a manutenção geral do neurônio e sua conexões sinápticas⁵. A mensuração das taxas de síntese de proteínas cerebrais pode ser uma ferramenta importante para o estudo de alterações adaptativas, bem como distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios relacionados à aprendizagem e à memória.

Desenvolvemos um método para quantificar as taxas de síntese protéica cerebral in vivo em um animal acordado que oferece vantagens inerentes a outras técnicas que estimam taxas em preparações ex vivo ou in vitro de tecido cerebral⁶. Acima de tudo é a aplicabilidade para medições no cérebro intacto em um animal acordado. Esta é uma consideração chave porque permite medições com estrutura sináptica e função no lugar e sem preocupações sobre efeitos post mortem. Além disso, a abordagem autoradiográfica quantitativa que empregamos atinge um alto grau de localização espacial. Considerando que a energia de ¹⁴C é tal que não podemos localizar o traçador no nível subcelular ou celular, podemos medir as taxas em camadas celulares e pequenas regiões cerebrais, como núcleos hipotalâmicos, com aproximadamente uma resolução de 25 μm⁷.

Um desafio de medições in vivo com radiofármacos é garantir que o radiomarcar medido está no produto da reação de interesse, em vez de precursor rotulado não reagido ou outros produtos metabólicos rotulados estranhos⁶. Nós escolhemos L-[1-¹⁴C]-leucina como o aminoácido Tracer porque é incorporado na proteína ou metabolizado ràpida a ¹⁴co_2, que é diluído na grande associação de co₂ sem rótulo no cérebro resultando da taxa elevada de metabolismo energético⁸. Além disso, qualquer ¹⁴c não incorporado em proteínas existe principalmente como livre [¹⁴c]-leucina, que durante o período experimental de 60 min, é quase totalmente eliminada do tecido⁶. As proteínas são então fixadas ao tecido com formalina e posteriormente enxaguadas com darágua remover qualquer livre [¹⁴C]-leucina antes da autoradiografia.

Outra consideração importante é a questão da diluição da atividade específica da Associação de aminoácidos precursores por aminoácidos não rotulados derivados da proteólise tecidual. Nós mostramos que no rato e no rato adultos, aproximadamente 40% do pool da leucina do precursor para a síntese da proteína no cérebro vem dos ácidos aminados derivados da avaria⁶da proteína. Isso deve ser incluído no cálculo das taxas regionais de síntese de proteínas cerebrais (rCPS) e deve ser confirmado em estudos em que essa relação pode mudar. A base teórica e os pressupostos do método foram apresentados em detalhes em outros lugares⁶. Neste artigo, focamos as questões processuais da aplicação desta metodologia.

Este método tem sido empregado para a determinação de RCPS em esquilos terrestres⁹, ovinos¹⁰, macacos rhesus¹¹, ratos^{12,13,14,15,16 , 17} anos de ^{, 18 anos} de ^{, 19} anos de ^{, 20} anos de ^{, 21}, um modelo do rato do complexo de esclerose tuberosa²², um modelo do rato da síndrome frágil de x²³,^24,25,26, ratos frágeis da pré-mutação de x²⁷, e um modelo do rato do fenilcetonúria²⁸. Neste manuscrito, apresentamos os procedimentos de mensuração de rCPS com o método in vivo autoradiográfico L-[1-¹⁴C]-leucina. Nós apresentamos rCPS em regiões do cérebro de um rato acordado do controle. Nós igualmente demonstramos que in vivo a administração do anisomycin, um inibidor da tradução, abole a síntese da proteína no cérebro.

Protocol

Nota: todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Instituto Nacional de saúde mental e Comitê de uso de animais e foram realizados de acordo com os institutos nacionais de diretrizes de saúde sobre o cuidado e uso de animais. Uma visão geral do protocolo é apresentada na Figura 1. 1. implante cirurgicamente cateteres em veia femoral e artéria para administração do traçador e coleta de amostras de sangue arterial cronometr…

Representative Results

Aqui nós mostramos uma experiência representativa que demonstra os efeitos da administração prévia de um inibidor da síntese da proteína em rCPS. Anisomycin no soro fisiológico normal foi administrado a um rato selvagem-tipo masculino adulto de C57/BL6 por via subcutânea (100 MGS/quilograma) 30 minutos antes do início da determinação de RCPS. Os efeitos do tratamento com anisomicina em comparação com um animal de controle tratado pelo veículo mostram que o rCPS é quase ind…

Discussion

Nós apresentamos um método quantitativo para a determinação de taxas regionais da síntese da proteína cerebral (rCPS) in vivo em animais experimentais. Este método tem vantagens consideráveis sobre os métodos existentes: 1. as medidas são feitas no animal de comportamento acordado, assim que refletem processos contínuos no cérebro de funcionamento. 2. as medições são feitas por meio de autoradiografia quantitativa, proporcionando a capacidade de determinar os rCPS em todas as regiões e sub-regiões do cé…

Materials

Mice	The Jackson Laboratory	003024	Fmr1 knockout breeding pairs
Anisomycin	Tocris Bioscience	1290
Microhematocrit Tubes	Drummond Scientific	1-000-3200-H	capillary tubes
Critoseal Capillary Tube Sealant	Leica Microsystems	39215003	sealant putty
Glass vial inserts	Agilent	5183-2089	used to collect blood samples
Digi-Med Blood Pressure Analyzer	Micro-Med Inc.	BPA-400	blood pressure analyzer
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System	Bayer Breeze	9570A	glucose meter
Gastight syringe	Hamilton Co.	1710	tuberculin glass syringe
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers	HeatMax	Model HH2	warming pads
Heparin Lock Flush Solution	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	heparin saline
Clear animal container	Instech	MTANK/W	animal enclosure
Spring tether	Instech	PS62	catheter tube/rodent attachment
Swivel	Instech	375/25	hooks to spring tether
Swivel arm and mount	Instech	SMCLA	hooks to swivel and animal enclosure
Tether button	Instech	VAB62BS/22	attaches to bottom of spring tether
Stainless steel tube	Made in-house	N/A	used to snake catheters through mouse
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	isoflurane vaporizer
Isoflurane	Stoelting Co.	50207	isoflurane/halothane adsorber
Clippers	Oster Finisher	Model 59
Surgical skin hooks	Made in-house (??)	N/A (??)
0.9% Sodium Chloride Saline	APP Pharmaceuticals LLC	918610
Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Surgical scissors	Fine Science Tools	14058-11
Microscissors	Fine Science Tools	15000-00
UNIFY silk surgical sutures	AD Surgical	#S-S618R13	6-0 USP, non-absorbable
PE-8 polyethylene tubing	SAI Infusion Technologies	PE-8-25
Syringe	Becton Dickinson and Co.	309659	1cc/mL
PE-10 polyethylene tubing	Clay Adams	427400
MCID Analysis	Imaging Research Inc.	Version 7.0	optical density analysis
Gelatin-coated slides (75x25mm)	FD Neurotechnologies	PO101
Cryostat	Leica	CM1850
Super RX-N medical x-ray film	Fuji	47410-19291
Hypercassettes (8×10 in)	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C]leucine	Moravek	MC404E
Microcentrifuge tube	Sarstedt Aktiengesellschaft & Co.	72.692.005	used to deproteinize blood samples
Glass pasteur pipette	Wheaton	357335
Glass wool	Sigma-Aldrich	18421
Nitrogen	NIH Supply Center	6830009737285
Scintillation fluid	CytoScint	882453
Liquid scintilllation counter	Packard Tri-Carb	2250CA
Amino acid analyzer	Pickering Laboratories	Pinnacle PCX
HPLC unit	Agilent Technologies	1260 Infinity	include 1260 Bio-Inert Pump
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	M650
Sulfosalicylic acid	Sigma-Aldrich	MKBS1634V	5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine	Sigma	N8513
1.0 N HCl	Sigma-Aldrich	H9892
[H3]leucine	Moraevk	MC672
Falcon tube	Thermo Scientific	339652	50 mL conical centrifuge tubes
Stopwatch	Heuer Microsplit	Model 1000	1/100 min
Euthanasia Solution	Vet One	H6438
Northern Light Precision Illuminator	Imaging Research Inc.	Model B95	fluorescent light box
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8	Nikon	1442	CDD camera