والرزن Efflux الفائق المسمى نيتروبينزوكساديازولي نسبة الكولسترول في الدم
Summary
قياس القدرة افلوكس نسبة الكولسترول في الدم في المختبر للمصل أو البلازما في نماذج خلية سنخية أداة واعدة كالعلامات البيولوجية لتصلّب الشرايين. في الدراسة الحالية، وتحسين وتوحيد أسلوب efflux بنك دبي الوطني-الكوليسترول فلورسنت ووضع تحليل الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا.
Abstract
تصلب الشرايين يؤدي إلى أمراض القلب والأوعية الدموية (الرسوم التعويضية). لا يزال غير واضح ما إذا كان تركيز الكوليسترول في الدم-الحميد (تشدل) يلعب دوراً سببية في تطور تصلب الشرايين. ومع ذلك، عاملاً هاما في المراحل الأولى من تشكيل اللوحة عصيدة هو الكوليسترول افلوكس القدرة على الحميد (قدرة جسيمات HDL على قبول نسبة الكولسترول في الدم من الضامة) تفاديا لتشكيل خلية الرغاوي. هذا خطوة أساسية في تجنب تراكم الكولسترول في البطانة وجزء من الكوليسترول عكس النقل (RCT) للقضاء على نسبة الكولسترول في الدم عن طريق الكبد. نسبة الكولسترول في الدم افلوكس القدرات للمصل أو البلازما في نماذج خلية سنخية هو أداة واعدة التي يمكن استخدامها كالعلامات البيولوجية لتصلّب الشرايين. وتقليدياً، [ح]3[-الكوليسترول وقد استخدمت في فحوصات افلوكس نسبة الكولسترول في الدم. في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى وضع استراتيجية أكثر أماناً وأسرع استخدام الفلورية المسمى-الكوليسترول (دبي-الكوليسترول) في مقايسة خلوية لتتبع عملية امتصاص و efflux الكولسترول في الضامة THP-1-مشتقة. أخيرا، نحن تحسين وتوحيد الأسلوب efflux بنك دبي الوطني-الكوليسترول ووضع تحليل الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا.
Introduction
ووفقا “منظمة الصحة العالمية”، هي الحالية الأسباب الرئيسية للوفاة في العالم مرض القلب الاقفاري والسكتة الدماغية (في حساب إجمالي الوفيات 15.2 مليون)1. كلاهما أمراض القلب والأوعية الدموية (الرسوم التعويضية) التي يمكن أن تكون مسبوقة بتصلب الشرايين وتمزق لويحات عصيدة في الأوعية الدموية2،3.
تصلب الشرايين هو سفينة جدار مرض تحريضية التي الضامة وخلايا T وخلايا ماست والخلايا الجذعية التسلل البطانة وتتراكم في الدم، في نهاية المطاف تشكيل لويحات تصلب الشرايين. يقدم لويحات تصلب الشرايين الدهون البلورات الأساسية ونسبة الكولسترول في الدم، ويتضح من قياسات الموجات فوق الصوتية ب-وضع الاستبانة البطانية السباتي الوسائط سمك4،5. الضامة، ينفذ efflux الكولسترول نحو جزيئات الدهن يقبلون بالوسائل مستقبلات كاسيت (ABC) ملزمة ATP ABCA1، ATP ملزمة كاسيت الفصيلية ز الأعضاء 1 (ABCG1)، ومستقبلات الزبال ريال والثنائي. ويعتبر عدم التوازن في تدفق نسبة الكولسترول في الدم وافلوكس في الضامة عملية رئيسية في تصلب الشرايين بدء6. افلوكس نسبة الكولسترول في الدم ويعتبر خطوة أساسية في القضاء على نسبة الكولسترول في الدم من الأنسجة الطرفية للبلازما والكبد في عملية تسمى الكوليسترول عكس النقل (RCT). يتم نقل الكوليسترول في الدم من الضامة أساسا إلى الابوليبوبروتين A1 (ApoA1) الموجودة على سطح جزيئات البروتين الدهني الكثافة (HDL). ثم النقل HDLs الكوليسترول إلى الكبد لإفراز وإعادة استعمال7،،من89.
تقليديا، الكولسترول وصفت الإذاعة التريتيوم (3ح) قد استخدمت في نسبة الكولسترول في الدم افلوكس10. إشارة الانبعاثات من النظائر المشعة هي حساسة للغاية10؛ ومع ذلك، يعرض الكولسترول وصفت الإذاعة المعوقات الواضحة مثل بروتوكولات طويلة وخطر التعرض للإشعاعات المؤينة، والحاجة إلى مرافق النشاط الإشعاعي الخاصة والمعدات لضمان المناولة الآمنة للانبعاثات المشعة. على العكس من ذلك، أدرجت الأسفار بنجاح في تقنيات التشخيص نظراً لبساطته في الكشف عن إشارة الفلورسنت، وتشكيله واسعة من فلوروفوريس المتاحة، و سلامة11. استخدمت عدة والاستيرولات المسمى الفلورسنت لدراسة الأيض نسبة الكولسترول في الدم بما في ذلك ديهيدرورجوستيرول (مع الأسفار الجوهرية)، والكوليسترول دانسيل، 4, 4-ديفلورو-3 أ، 4adiaza-s-إينداسيني (بوديبي)-نسبة الكولسترول في الدم، و 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (دبي-الكوليسترول في الدم). خاصة، يقدم بنك دبي الوطني-الكوليسترول كفاءة امتصاص في الخلايا البشرية12. اثنين مختلفة بنك دبي الوطني المسمى الكولسترول المتوفرة حاليا: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-بنك دبي الوطني) و 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-بنك دبي الوطني؛ الشكل 1). نسبة الكولسترول في الدم المسمى مع مجموعة 22-بنك دبي الوطني قد تناسب الدراسات افلوكس نسبة الكولسترول في الدم، بينما 25-دبي-الكولسترول وهي تستخدم أساسا في الغشاء الخلوي ديناميات البحث13،14.
هي خطوط الخلايا المستخدمة عادة في نسبة الكولسترول في الدم في المختبر فحوصات efflux الوحيدات مثل الخلايا مثل الخلايا البشرية THP-1 المستمدة من سرطان الدم أو الخلايا 264.7 الخام موريني15J774.1. كل من هذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في الضامة في المختبر باستخدام phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، ولكن تعكس THP-1-المستمدة الضامة (دمثب-1) أفضل وتقليد الضامة البشرية16.
في الدراسة الحالية، وتحسين وتوحيد أسلوب الفائق فلورسنت لتحديد قدرة efflux الكولسترول عينات المصل في دمثب-1، باستخدام الكولسترول-22-بنك دبي الوطني كبديل ل [ح]3[-نسبة الكولسترول في الدم. وباﻹضافة إلى ذلك، قارنا تقنية نيون الأمثل مع التناظرية المشعة القياسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكوليسترول المسمى الفلورسنت استراتيجية واعدة لتحليل والتحقيق في خصائص واستقلاب الكوليسترول الطبيعية في المختبر. مميزاتها الرئيسية هي أنه يمكن أن تتناولها الخلايا، ويسمح لداخل الخلية والغشاء توزيع الدراسات، ويمكن تطبيقها على نسبة الكولسترول في الدم افلوكس فحوصات مثل هذا البروتوكول (<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دعمت هذا العمل جزئيا بالمنح البحثية الجبهة الإسلامية للإنقاذ (PS12/00866) من معهد الصحة كارلوس الثالث، مدريد، إسبانيا؛ ش الفقرة Europeo فوندو التنمية الإقليمية (فدر)؛ الأحمر لبحوث أون سيدا (RIS)، إيسسيي-ريتيك (RD16/0025/0002) وبرنامج سيركا/محافظة كاتالونيا. يشكر المؤلفون ريتروفيرولوجي والفيروسية مختبر إيمونوباثولوجي من معهد d’Investigacions Biomèdiques آب/أغسطس Pi I سونير (إيديبابس). نشكر ت. Escribà وجيم-روفيرا هورتادو جيم للمساعدة و Cufí س. من مكتب نقل التكنولوجيا والمعرفة لتوجيهاتها في حماية الاختراع.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Referências
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
