High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay
Summary
Meting van in vitro cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument als een biomarker voor atherosclerose. In de huidige studie, optimaliseren wij en een fluorescerende NBD-cholesterol efflux methode standaardiseren en ontwikkelen van een hoge-doorvoer-analyse met behulp van 96-wells-platen.
Abstract
Arteriosclerose leidt tot hart-en vaatziekten (HVZ). Het is nog onduidelijk of de concentratie cholesterol-HDL (cHDL) een oorzakelijke rol speelt in de ontwikkeling van atherosclerose. Echter, een belangrijke factor in de vroege stadia van de atheroma plaque vorming is cholesterol efflux capaciteit aan HDL (de mogelijkheid van HDL-deeltjes te accepteren van cholesterol van macrofagen) om te voorkomen dat schuim celvorming. Dit is een belangrijke stap bij het vermijden van de ophoping van cholesterol in het endotheel en een deel van reverse cholesteroltransport (RCT) om te heffen van cholesterol door de lever. Cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument dat kan worden gebruikt als biomerker voor atherosclerose. Traditioneel, [3H]-cholesterol is gebruikt in cholesterol efflux testen. In deze studie streven wij naar het ontwikkelen van een strategie van het veiliger en sneller met behulp van fluorescerende geëtiketteerd-cholesterol (NBD-cholesterol) in een cellulaire assay voor het traceren van het cholesterol opname efflux proces en in macrofagen THP-1-afgeleide. Tot slot, wij optimaliseren en standaardiseren van de NBD-cholesterol efflux methode en ontwikkelen van een high-throughput-analyse met behulp van 96-wells-platen.
Introduction
Volgens de World Health Organization zijn de huidige belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd ischemische hartziekte en beroerte (accounting voor een totaal van 15,2 miljoen doden)1. Beide zijn cardiovasculaire aandoeningen (CVD) die kunnen worden voorafgegaan door atherosclerose en de breuk van atheroma plaques in de bloedvaten2,3.
Atherosclerose is een vaartuig muur ontstekingsziekte waarin macrofagen, T-cellen, mestcellen en dendritische cellen infiltreren het endotheel en uit het bloed, uiteindelijk de vorming van atherosclerotische plaques ophopen. Atherosclerotische plaques presenteren een lipide kern en cholesterol kristallen, blijkt uit de hoge resolutie B-modus Ultrasonografie metingen van de carotis intima media dikte4,5. In macrofagen, wordt cholesterol efflux naar lipide acceptor deeltjes uitgevoerd door middel van de ATP-binding cassette (ABC) receptoren ABCA1, ATP-binding cassette onderfamilie G lid 1 (ABCG1), en de scavenger receptor SR-BI. Het gebrek aan evenwicht van cholesterol toestroom en efflux in macrofagen wordt beschouwd als een belangrijke proces in atherosclerose Inleiding6. Cholesterol efflux wordt beschouwd als een belangrijke stap in de eliminatie van cholesterol uit perifere weefsel aan het plasma en de lever in een proces genaamd reverse cholesteroltransport (RCT). Cholesterol wordt overgebracht van macrofagen voornamelijk aan apolipoproteïne A1 (ApoA1) gevonden op het oppervlak van high-density lipoproteïne (HDL) deeltjes. HDLs vervoer dan cholesterol naar de lever voor uitscheiding en hergebruikt7,8,9.
Tritium (3H) radioactief gemerkte cholesterol is traditioneel gebruikt in cholesterol efflux10. Het signaal van de emissie van radio-isotopen is zeer gevoelige10; radioactief gemerkte cholesterol kampt echter voor de hand liggende handicaps zoals lange protocollen, risico van blootstelling aan ioniserende straling en de noodzaak van speciale radioactiviteit faciliteiten en apparatuur om ervoor te zorgen veilig omgaan met radioactieve emissies. Integendeel, is fluorescentie met succes overgenomen in diagnostische technieken vanwege zijn eenvoud in fluorescerende signaal detectie, de grote verscheidenheid van fluorophores beschikbaar en zijn veiligheid11. Verschillende TL-gelabelde Sterolen zijn gebruikt voor het bestuderen van cholesterol metabolisme met inbegrip van dehydroergosterol (met intrinsieke fluorescentie), dansyl cholesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) – cholesterol, en 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-cholesterol). NBD-cholesterol presenteert in het bijzonder een efficiënte opname in menselijke cellen12. Twee verschillende NBD geëtiketteerd-cholesterol zijn momenteel beschikbaar: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) en 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figuur 1). Cholesterol geëtiketteerd met 22-NBD deel kan best past bij cholesterol efflux studies, terwijl 25-NBD-cholesterol voornamelijk in cellulaire membraan dynamics onderzoek13,14 gebruikt wordt.
Cellijnen meestal gebruikt in in vitro cholesterol efflux testen zijn monocyt-achtige cellen zoals THP-1 voor menselijke leukemie-afgeleide cellen, lymfkliertest Raw 264.7 cellen15of J774.1. Al deze cellen kunnen worden onderscheiden in macrofagen in vitro met behulp van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), maar THP-1-afgeleide macrofagen (dmTHP-1) beste weerspiegelen en de menselijke macrofagen16na te bootsen.
In de huidige studie, we optimaliseren en standaardiseren van een fluorescerende high-throughput methode om te bepalen de cholesterol efflux capaciteit van serummonsters op dmTHP-1, met behulp van 22-NBD-cholesterol als alternatief voor [3H]-cholesterol. Daarnaast vergelijken wij de geoptimaliseerde fluorescerende techniek met de standaard radioactieve analoge.
Protocol
Representative Results
Discussion
TL-gelabelde cholesterol is een veelbelovende strategie om te analyseren en onderzoeken van de eigenschappen en het metabolisme van natuurlijke cholesterol in vitro. De belangrijkste voordelen zijn dat het kan worden overgenomen door cellen, toelaat voor intracellulaire en membraan distributie studies, en kan worden toegepast op cholesterol efflux assays zoals in dit protocol (Figuur 7). Aantal TL-gelabelde sterolen toestaan cholesterol bijhouden in vitro met inbegrip van BODIPY-cholesterol,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het onderzoek verleent FIS (PS12/00866) van het Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (EFRO); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) en CERCA programma / Generalitat de Catalunya. De auteurs bedanken de Retrovirology en virale Immunopathologie laboratorium van het Institut d’Investigacions Biomèdiques augustus Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wij danken T. Escribà, C. Rovira en C. Hurtado voor hun hulp en S. Cufí van de kennis en de technologie Transfer Office voor haar begeleiding bij de bescherming van de uitvinding.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Referências
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).
- Ilhan, F. Atherosclerosis and the role of immune cells. World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345 (2015).
- Greaves, D. R., Gordon, S. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. Trends Immunol. 22, (2001).
- Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).
- Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection. Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).
- Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL. Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).
- Hafiane, A., Genest, J. HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method. Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).
- Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature. Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).
- Mcintosh, A. L., et al. Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells. Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).
- Ostašov, P., et al. FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion. Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).
- Song, W., et al. Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages. Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).
- Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages. Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).
- Qin, Z. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).
- Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. Cholesterol Efflux Assay. Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).
- Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. Cholesterol reporter molecules. Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).
- Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol. ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).
- Rader, D. D. J. Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).
- Davidson, W. S., et al. The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function. Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).
- Park, S. H., et al. Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).
- Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches. Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).
- Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).
- Rohatgi, A., et al. HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events. New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).
