높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과
Summary
혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마를 생체 외에서 콜레스테롤 경과 용량 측정은 동맥 경화에 대 한 biomarker로 유망한 도구입니다. 현재 연구에서 우리 최적화 및 형광 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.
Abstract
동맥 경화는 심장 혈관 질병 (CVD)에 리드. 그것은 여전히 분명 콜레스테롤-HDL (cHDL) 농도 롬 개발에 인과 역할을 담당 하는 여부입니다. 그러나, atheroma 플 라크 형성의 초기 단계에서 중요 한 요소는 콜레스테롤 경과 용량 HDL (동의 대 식 세포에서 콜레스테롤을 HDL 입자의 능력)을 거품 세포 형성을 피하기 위하여. 이것은 endothelium 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT)를 통해 콜레스테롤 제거의 부분에 콜레스테롤의 축적을 방지에 중요 한 단계 이다. 혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마 콜레스테롤 경과 용량 동맥 경화에 대 한 biomarker로 사용 될 수 있는 유망한 도구입니다. 전통적으로, [3H]-콜레스테롤은 콜레스테롤 경과 분석 실험에 사용 되었습니다. 이 연구에서 우리 THP 1 파생 된 세포에 콜레스테롤 통풍 관 및 경과 과정을 추적 하는 세포 분석 결과에서 형광 표시-콜레스테롤 (NBD-콜레스테롤)을 사용 하 여 안전 하 고 빠른 전략을 개발 목표로 합니다. 마지막으로, 우리 최적화 및 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.
Introduction
세계 보건 기구에 따르면는 현재 교장의 죽음은 전세계 원인은 허 혈 성 심장 질환과 뇌졸중 (15.2 백만 죽음의 총에 대 한 회계)1. 둘 다 심장 혈관 질병 (CVD) 동맥 경화 및 혈관2,3atheroma 플 라크의 파열에 의해 선행 될 수 있습니다.
동맥 경화는 혈관 벽 염증 성 질환 대 식 세포, T 세포, 돛대 세포 그리고 수지상 세포는 내 피를 침투와 결국 동맥 경 화성 플 라크를 형성 하는 혈액에서 축적 이다. 동맥 경 화성 플 라크는 지질 코어 및 콜레스테롤 결정, 경 동맥 intima 미디어 두께4,5의 고해상도 B 모드 초음파 측정에 의해 입증 제시. 세포, 지질 수락자 입자 쪽으로 콜레스테롤 경과 ABCA1, ATP 의무적인 카세트 G 인도의 회원 1 ATP 묶는 카세트 (ABC) 수용 체의 수단 (ABCG1), 및 SR-BI 폐품 수용 체에 의해 수행 됩니다. 콜레스테롤 유입 및 세포에 경과의 불균형 동맥 경화 개시6핵심 과정으로 간주 됩니다. 콜레스테롤 경과 플라즈마 주변 조직에서 콜레스테롤 제거에 중요 한 단계 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT) 라는 프로세스에서 간으로 간주 됩니다. 콜레스테롤은 세포 apolipoprotein A1에 주로 (ApoA1) 고밀도 지단백 (HDL) 입자의 표면에서 발견에서 전송 됩니다. HDLs는 다음 배설 및 재 사용률7,,89간 콜레스테롤 수송.
전통적으로, 트리 티 움 (3H) 라디오 이라는 콜레스테롤 콜레스테롤 경과10에 사용 되었습니다. Radioisotopes의 방출 신호는 매우 민감한10; 그러나, 라디오 이라는 콜레스테롤 긴 프로토콜, 이온화 방사선에 노출의 위험과 방사성 방출의 안전한 취급을 위해 특별 한 방사능 시설 및 장비에 대 한 필요성 등 분명 한 장애를 선물 한다. 그와 반대로, 형광은 형광 신호 검색과 fluorophores 사용할 수의 광범위 한, 그것의 안전11에 그것의 단순 진단 기법에 성공적으로 통합 되었습니다. 여러 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 물질 대사 (본질적인 형광)와 dehydroergosterol, dansyl 콜레스테롤, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) 연구에 사용 되었습니다-콜레스테롤, 및 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD-콜레스테롤)입니다. 특히, NBD 콜레스테롤 인간 세포12효율적인 통풍 관을 선물 한다. 두 개의 다른 NBD 표시-콜레스테롤 현재 사용할 수 있습니다: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) 및 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; 그림 1)입니다. 25-NBD-콜레스테롤은 세포 막 역학 연구13,14에서 주로 사용 하는 동안 22 NBD moiety 함께 셔 서 콜레스테롤 콜레스테롤 경과 연구에 맞게 최고의 수 있습니다.
일반적으로 생체 외에서 콜레스테롤 경과 분석 실험에서 사용 하는 셀 라인 인간의 백혈병 파생 THP-1 셀, murine Raw 264.7 세포15또는 J774.1 같은 monocyte 모양의 세포 이다. 이러한 셀의 모든 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)를 사용 하 여 체 외에서 세포로 분화 될 수 있다 하지만 THP 1 파생 된 대 식 세포 (dmTHP-1) 최고의 반영 하 고 인간의 세포16모방.
현재 연구에서 우리는 최적화 하 고 22 NBD 콜레스테롤 [3H] 하는 대신 사용 하 여 dmTHP-1, 혈 청 샘플의 콜레스테롤 경과 용량을 결정 하는 형광 높은 처리량 방법을 표준화-콜레스테롤. 또한, 우리는 표준 방사성 아날로그와 최적화 된 형광 기법을 비교합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
형광 표시 콜레스테롤은 분석 하 고 속성 및 자연 콜레스테롤 체 외의 물질 대사를 조사 하는 유망한 전략 이다. 그것의 주요 이점은 그것은 세포에 의해 채택 될 수 있다, 세포내 수 막 유통 연구, 콜레스테롤 경과 분석 실험 등이 프로토콜 (그림 7)에 적용할 수 있습니다. 일부 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 추적 BODIPY-콜레스테롤, dansyl 콜레스테롤, dehydroegrosterol, 및 22 및 25-N…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 지원 된 연구 기관 드 건배 카를로스 III에 마드리드, 스페인;에서 FIS (PS12/00866) 부여 Fondo Europeo 파라 엘 개발 지역 (페더); 레드 드 Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) 및 검색 프로그램 / Generalitat 드 Catalunya. 저자는 Retrovirology 인 d’Investigacions Biomèdiques 8 월 Pi 나 Sunyer (IDIBAPS)의 바이러스 Immunopathology 실험실을 감사합니다. 우리 감사 합니다 T. Escribà, C. Rovira, 및 C. Hurtado 그들의 지원 및 지식 및 기술 이전 사무실에서 S. Cufí에 대 한 발명을 보호에 대 한 그녀의.
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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