高通量硝基苯并二氮唑标记的胆固醇积液测定
Summary
在巨噬细胞模型中测量血清或血浆的体外胆固醇流出能力是动脉粥样硬化的一个很有前途的工具。在本研究中, 我们优化和规范了荧光 nbd-胆固醇外排法, 并开发了一个使用96孔板的高通量分析。
Abstract
动脉粥样硬化导致心血管疾病 (cvd)。目前尚不清楚胆固醇-高密度脂蛋白 (chdl) 浓度是否在动脉粥样硬化的发展中起因果作用。然而, 动脉粥样硬化斑块形成早期的一个重要因素是胆固醇流出能力的 hdl (hdl 颗粒接受胆固醇从巨噬细胞), 以避免泡沫细胞的形成。这是避免胆固醇在内皮细胞中积累的关键一步, 也是通过肝脏消除胆固醇的反向胆固醇转运 (rct) 的一部分。巨噬细胞模型中的胆固醇流出能力对血清或血浆的影响是一种很有前途的工具, 可作为动脉粥样硬化的生物标志物。传统上, [3h]-胆固醇已用于胆固醇外排分析。在这项研究中, 我们的目标是开发一个更安全和更快的策略, 使用荧光标签胆固醇 (nbd-胆固醇) 在细胞检测, 以跟踪胆固醇的吸收和流出过程中的 thp-1 衍生的巨噬细胞。最后, 我们对 nbd-胆固醇流出法进行了优化和规范, 并开发了一种利用96孔板进行高通量分析的方法。
Introduction
根据世界卫生组织的数据, 全世界目前的主要死亡原因是缺血性心脏病和中风 (死亡总人数为 1 520万人) 1.两者都是心血管疾病 (cvd), 可在动脉粥样硬化和血管破裂 2, 3.
动脉粥样硬化是一种血管壁炎症性疾病, 其中巨噬细胞、t 细胞、肥大细胞和树突状细胞浸润内皮细胞并从血液中积累, 最终形成动脉粥样硬化斑块。动脉粥样硬化斑块呈现脂质核和胆固醇晶体, 证明了高分辨率 b 超测量颈动脉内膜介质厚度4,5。在巨噬细胞中, 胆固醇流出对脂质受体颗粒是通过 atp 结合盒 (abc) 受体 abca1, atp 结合盒子家族 g 成员 1 (abcg1), 和清除剂受体 sr-bi 进行的。巨噬细胞中胆固醇流入和流出的不平衡被认为是动脉粥样硬化发生的一个关键过程6。胆固醇流出被认为是消除胆固醇从外周组织到血浆和肝脏的关键一步, 这个过程被称为反向胆固醇转运 (rct)。胆固醇主要从巨噬细胞转移到高密度脂蛋白 (hdl) 颗粒表面发现的载脂蛋白 a1 (apoa1)。然后, 高密度脂蛋白将胆固醇输送到肝脏进行排泄和再利用7,8,9。
传统上, (3h) 放射性标记的胆固醇已被用于胆固醇排出10。放射性同位素发射信号高度敏感10;然而, 放射性标记的胆固醇存在明显的障碍, 如长期的规程、电离辐射照射的风险, 以及需要特殊的放射性设施和设备来确保安全处理放射性排放。相反, 荧光已成功地纳入诊断技术, 因为它在荧光信号检测简单, 荧光种类繁多, 并具有安全性11。几种荧光标记的甾醇已被用于研究胆固醇代谢, 包括脱氢雌酚 (具有内在荧光)、丹西胆固醇、4, 4-二氟-3, 4adia-s-indacene (body y)-胆固醇和 22-(n-(7-硝基苯甲酸-2-oxa-1, 3-diazol-4-基)-23, 24-bisnor-5 choren-3β-ol (nbd-胆固醇)。特别是, nbd 胆固醇在人的细胞中具有有效的吸收12。目前有两种不同的 nbd 标签胆固醇:22-(n-(n-(7-硝基苯-2-o理事会-1, 3-二唑-4-基) 氨基)-23, 24-双苯-5-胆碱-3b-ol (22-nbd) 和 25-(n-[(7-硝基苯-2-氧-1, 3-二唑-4-基)-甲基] 氨基)-27-不高胆固醇 (25-nbd;图 1)。标记为22-nbd 的胆固醇可能最适合胆固醇外排研究, 而25-NBD-cholesterol 胆固醇主要用于细胞膜动力学研究13,14。
细胞系通常用于体外胆固醇排出分析是单核细胞样细胞, 如人类白血病衍生的 thp-1 细胞, 小鼠原始264.7 细胞15, 或 j774.1。所有这些细胞都可以用 phorbol 12-mristate 13 乙酸 (pma) 在体外分化为巨噬细胞, 但 thp-1 衍生巨噬细胞 (dthp-1) 最能反映和模仿人类巨噬细胞16。
在本研究中, 我们利用22-NBD-cholesterol 胆固醇作为 [3h]-胆固醇的替代品, 优化和规范荧光高通量法, 以确定 dmthp-1 上血清样品的胆固醇流出能力。此外, 我们还将优化后的荧光技术与标准放射性模拟技术进行了比较。
Protocol
Representative Results
Discussion
荧光标记胆固醇是分析和研究天然胆固醇体外特性和代谢的一种很有前途的策略。它的主要优点是, 它可以被细胞吸收, 允许细胞内和膜内的分布研究, 并可以应用于胆固醇外排检测, 如在本协议中 (图 7)。一些被荧光标记的甾醇允许在体外跟踪胆固醇, 包括身体胆固醇, 丹西胆固醇, 脱氢雌酚,和 22-和25-nbd-低压12。特别是, 22-nbd-胆固醇是适当的研究不同细胞类?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了西班牙马德里 salud carlos iii 研究所 fis (ps12/00866) 研究赠款的部分支持;fondo euroo para el desarrollo 区域 (fder);red de research ación en sida (ris)、isciii-retic (rd16/h500/0002) 和 cerca 方案/generalitat de catalunya。作者感谢生物研究研究所的逆转录病毒学和病毒免疫病理学实验室。我们感谢特塞兹帕、罗维拉和 c. hurtado 的协助, 并感谢知识和技术转让办公室的 s. cufí在保护发明方面的指导。
Materials
| 96-well collecting plate | Corning Inc | Costar 3912 | white 96-well plate with opaque clear bottom |
| 96-well culture plate | Corning Inc | Costar 3610 | white 96-well plate with flat clear bottom |
| Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based) | Abcam | ab196985 | commercial high-throughput cell-based assay kit aimed to determine the cholesterol efflux |
| colorless RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 with no pehnol-red |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Version 2.0 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glycine, non-animal use |
| Luminometer | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | in-house | 50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl and H2O | |
| Lysis Solution 2 | in-house | Pure ethanol and Cell Lysis Solution 1:1 (v:v) | |
| NBD-cholesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Phosphate-buffered saline |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polyethylene glycol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetate. |
| R10 | in-house | RPMI 1640 supplemented with 10 % fetal bovine serum and 5 % Penicillin/Streptomycin. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 with 2mM L-glutamine containing 1.5 g/L sodium bicarbonate and 4.5 g/L glucose |
| THP-1 cells | Sigma-Aldrich | ATCC, #TIB-202 | monocyte-like line derived from leukemia from a one year old baby |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
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