Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique
Summary
Tomographie par cohérence optique (OCT), une technologie d’imagerie en trois dimensions, a été utilisé pour surveiller et caractériser la cinétique de croissance des sphéroïdes multicellulaires de tumeur. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un voxel comptage approche et la détection de tissu mort exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basé sur contraste intrinsèque d’atténuation optique, ont été démontrées.
Abstract
Sphéroïdes de tumeur ont été développées comme un modèle de culture en trois dimensions (3D) cellule en découverte de médicaments contre le cancer et de recherche de cancer. Cependant, actuellement, haut-débit, modalités d’imagerie utilisant la détection de champ ou de la fluorescence lumineuse, sont incapables de résoudre la structure 3D dans l’ensemble de l’ellipsoïde de la tumeur en raison de la pénétration de la lumière limitée, diffusion des colorants fluorescents et profondeur-être. Récemment, notre laboratoire a démontré l’utilisation de la tomographie par cohérence optique (OCT), un sans étiquette et non destructifs en 3D imagerie modalité, pour effectuer la caractérisation longitudinale des sphéroïdes multicellulaires tumeur dans une plaque à 96 puits. OCT a été capable d’obtenir des informations morphologiques et physiologiques 3D des sphéroïdes de tumeur de plus en plus jusqu’à environ 600 µm de hauteur. Dans cet article, nous démontrons un système d’imagerie de OCT (HT-OCT) haut débit qui balaye la plaque multipuite ensemble et obtient automatiquement les données 3D de OCT des sphéroïdes de tumeur. Les auteurs décrivent les détails des HT-OCT système et construction établies dans le protocole. Partir des données 3D de OCT, on peut visualiser la structure globale de l’ellipsoïde avec 3D rendu et tranches orthogonaux, caractériser la courbe de croissance longitudinale de l’ellipsoïde de tumeur basée sur l’information morphologique de la taille et le volume et surveiller la croissance des les régions de cellules mortes dans la sphéroïde de tumeur basé sur contraste optique atténuation intrinsèque. Nous montrons que HT-OCT est utilisable comme une modalité d’imagerie haut débit pour médicament dépistage mais aussi caractériser biofabricated échantillons.
Introduction
Le cancer est la deuxième cause de décès dans le monde1. Développement de médicaments ciblant le cancer est d’une importance cruciale pour les patients. Toutefois, on estime que plus de 90 % des nouveaux médicaments anticancéreux échouent dans la phase de développement en raison du manque d’efficacité et de toxicité imprévue dans les essais cliniques2. Une partie de la raison peut être attribuée à l’utilisation de modèles de culture cellulaire (2D) deux dimensions simples d’inspection/filtrage composé qui fournissent des résultats avec des valeurs prédictives limités composée efficacité et la toxicité pour les étapes suivantes de la drogue découverte2 , 3 , 4. récemment, en trois dimensions (3D) tumeur sphéroïde modèles ont été développés pour fournir des données physiologiques et pharmacologiques cliniquement pertinentes pour médicament anticancéreux découverte3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Puisque ces sphéroïdes peuvent imiter les propriétés spécifiques des tissus de tumeurs in vivo, comme des éléments nutritifs et l’oxygène gradient, hypoxique de base comme drogue résistance19, l’utilisation de ces modèles potentiellement peut raccourcir chronologies de découverte de drogue, réduire les coûts d’investissement et offrir de nouveaux médicaments aux patients plus efficacement. Une approche critique de l’évaluation efficacité composée en développement de sphéroïde de tumeurs 3D consiste à surveiller la croissance de sphéroïde et réapparition sous traitements9,26. Pour ce faire, la caractérisation quantitative de la morphologie de la tumeur, mettant en cause son diamètre et en volume, avec des modalités d’imagerie à haute résolution, est indispensable.
Modalités d’imagerie conventionnelles, comme champ lumineux, contraste de phase7,9,22,24et9,de8,de la microscopie de fluorescence16, 18,22 peut fournir une mesure du diamètre de l’ellipsoïde, mais ne peut pas résoudre la structure globale de l’ellipsoïde dans l’espace 3D. Plusieurs facteurs contribuent à ces limitations, y compris la pénétration de la lumière poussée dans la sphéroïde ; diffusion des colorants fluorescents dans la sphéroïde ; émettant des signaux fluorescents de fluorochromes excités à l’intérieur ou sur la surface opposée de l’ellipsoïde en raison de la forte absorption et de diffusion ; et profondeur-être de ces modalités d’imagerie. Cela conduit souvent à une volumétrie inexactes. Développement du noyau nécrotique en sphéroïdes imite la nécrose dans in vivo des tumeurs6,10,15,19,25. Cette caractéristique pathologique est peu probable que reproduit en 2D cell cultures19,25,27,28. Avec une taille de sphéroïde plue de 500 µm de diamètre, une structure de trois couches concentrique, dont une couche externe de cellules en prolifération, une couche intermédiaire de cellules quiescentes et un noyau nécrotique, peut être observée dans le sphéroïde6,10 ,15,19,25, à raison d’un manque d’oxygène et de nutriments. Imagerie de fluorescence des cellules vivantes et mortes est l’approche standard pour marquer la limite du noyau nécrotique. Cependant, encore une fois, pénétrations de ces colorants fluorescents et de la lumière visible entravent le potentiel de la sonde dans le noyau nécrotique pour suivre son évolution dans sa forme actuelle.
Une modalité d’imagerie de la 3D alternatif, tomographie à cohérence optique (OCT) est introduite afin de caractériser les sphéroïdes de tumeur. OCT est une technique d’imagerie biomédicale qui est capable d’acquérir des données 3D sans étiquette et non destructif de jusqu’à 1-2 mm de profondeur dans les tissus biologiques29,30,31,32,33 ,34. OCT emploie l’interférométrie faible cohérence pour détecter les signaux dos diffusée de différentes profondeurs de l’échantillon et fournit des images reconstruites résolue en profondeur au niveau du micron résolutions spatiales dans le sens latéral et vertical. OCT a été largement adoptée en ophtalmologie35,36,37 et angiographie38,39. Des études antérieures ont utilisé OCT pour observer la morphologie du in vitro sphéroïdes de tumeur dans la matrice de la membrane basale (p. ex., Matrigel) et évaluer leurs réponses à la thérapie photodynamique40,41. Récemment, notre groupe a créé une plate-forme d’imagerie OCT haut débit pour systématiquement surveiller et mesurer la cinétique de croissance des sphéroïdes tumeur 3D en plaques multipuits42. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur 3D à l’aide d’un voxel approche et détection des tissus nécrosés exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basée sur le contraste de l’atténuation optique intrinsèque de comptage ont été démontrées. Cet article décrit les détails de comment la plate-forme d’imagerie OCT a été construite et utilisée pour obtenir des images 3D à haute résolution des sphéroïdes de tumeur. Les analyses quantitatives détaillées de la cinétique de croissance des sphéroïdes tumeur 3D, y compris des mesures précises du diamètre de sphéroïde et de volumes, est décrite. En outre, la méthode de la détection non destructive des régions de tissus nécrosés aide OPO, basé sur le contraste de l’atténuation optique intrinsèque est présentée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Activité antitumorale est très importante pour sa structure morphologique. Semblable à la courbe de croissance caractéristique pour cultures cellulaires 2D de surveillance, suivi de la courbe de croissance pour les sphéroïdes tumeur 3D est également une approche conventionnelle de caractériser le comportement de la croissance à long terme sphéroïde pour différentes lignées cellulaires. En particulier, nous pouvons caractériser la réaction aux médicaments en analysant la dégradation de la tumeur ou tumeur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la NSF accorde IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (PII-1640707), fonds de démarrage de subventions R21EY026380, R15EB019704 et R01EB025209 et l’Université Lehigh NIH.
Materials
| Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
| Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
| 2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
| Reference Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Focusing Lens | Thorlabs | ||
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| 1D Translational Stage | Thorlabs | ||
| Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Sample Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Galvanometer | Thorlabs | ||
| Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
| Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| Objective | Mitutoyo | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Polarization Controller | Thorlabs | ||
| 30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
| Cage Rod | Thorlabs | ||
| Stage | |||
| 3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
| 2D Tilting Stage | |||
| Rotation Stage | |||
| Plate Holder | 3D printed | ||
| Spectrometer | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
| F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
| InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Component | |||
| HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
| Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
| Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
| Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
| Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
| Gloves | VWR | 89428-750 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
| Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
| Microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology & IHC | |||
| Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
| Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Commerical OCTs | |||
| SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
| SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software for Data Analyses | |||
| Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
| 3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
| 3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
| OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
| Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
| OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
| Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |
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