Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Summary

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Abstract

Esferoides de tumor foram desenvolvidas como um modelo de cultura tridimensional (3D) célula na descoberta de medicamentos de investigação e anti-câncer de câncer. No entanto, atualmente, elevado-throughput modalidades de imagem utilizando a deteção de campo ou fluorescência brilhante, são incapazes de resolver a estrutura geral 3D do spheroid tumor devido à limitada penetração de luz, difusão de corantes fluorescentes e profundidade-resolução. Recentemente, nosso laboratório demonstrou o uso de tomografia de coerência óptica (OCT), um rótulo livre e não-destrutiva de imagem 3D modalidade, para realizar a caracterização longitudinal de esferoides multicelulares tumor em uma placa de 96 poços. OCT foi capaz de obter informações morfológicas e fisiológicas 3D de esferoides de tumor que cresce até cerca de 600 µm de altura. Neste artigo, vamos demonstrar um sistema de imageamento de OCT (HT-OCT) de alto rendimento que verifica a placa toda multi bem e obtém os dados 3D OCT de esferoides tumor automaticamente. Descrevemos os detalhes das orientações de construção e sistema de HT-OCT no protocolo. A partir dos dados de OCT 3D, se pode visualizar a estrutura geral do spheroid com 3D renderizados e fatias ortogonais, caracterizar a curva de crescimento longitudinal do spheroid tumor baseado na informação morfológica de tamanho e volume e monitorar o crescimento de as regiões de mortos-célula no spheroid tumor baseado no contraste óptico atenuação intrínseca. Mostramos que, HT-OCT pode ser usado como uma modalidade de imagem de alto rendimento para droga triagem, bem como a caracterização de amostras de biofabricated.

Introduction

Câncer é a segunda principal causa de morte no mundo¹. Desenvolvimento de medicamentos, alvejando câncer é de importância crucial para os pacientes. No entanto, estima-se que mais de 90% das novas drogas anti-câncer falhar na fase de desenvolvimento devido à falta de eficácia e toxicidade inesperada em ensaios clínicos². Parte do motivo pode ser atribuída ao uso de modelos de cultura simples bidimensional (2D) célula para triagem composta, que fornecem resultados com valores preditivos limitados de compostos eficácia e toxicidade para as fases seguintes da droga descoberta^{2 ,}

Protocol

1. preparação das células

1. Obter linhas de células de um fornecedor qualificado.
   Nota: Verifique se as células a partir das linhas de células de interesse podem formar esferoide nos meios de cultura ou com a ajuda de um substrato (matriz de membrana basal como Matrigel). Olhar para a literatura⁹ ou realizar uma rodada de um pre-experimento de para uma verificação.
2. Descongele as células congeladas, seguindo o procedimento específico fornecido pelo fornecedor linha celular. Um procedimento geral pode ser encontrado em outro lugar⁴³.
3. Cultura de células para 1-2 passagens em frascos de cultura....

Results

Imagem de tomografia computadorizada coerência óptica alto Throughput de esferoides em uma placa de 96 poços

A Figura 3 exibe o resultado de HT-OCT digitalização de uma placa de 96 poços com 116 HCT esferoides de tumor no dia 3. A varredura sequencial da placa inteira começa a partir do poço do canto inferior direito (H12). Figura 3B mostra o fluxograma da implementação do.......

Discussion

Atividade de tumor é altamente relevante para sua estrutura morfológica. Semelhante à curva de crescimento característica de culturas celulares 2D de monitoramento, acompanhamento da curva de crescimento de esferoides tumor 3D é também uma abordagem convencional para caracterizar o comportamento de crescimento a longo prazo do esferoide para linhas celulares diferentes. Notavelmente, nós pode caracterizar a resposta de drogas através da análise de degradação de tumor ou tumor regrowth reflectida diretamente na curva de c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de imagem OCT de domínio espectral personalizado			Desenvolvido em nosso laboratório
Diodo superluminescente (SLD)	Thorlabs	SLD1325fonte de	luz
2 vezes; 2 acopladores de fibra fundida de modo único, taxa de divisão de 50:50	AC Photonics	WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Collimating Lens	Thorlabs	AC080-020-C
Lente de focagem	Thorlabs
Montagem de espelho cinemático	Thorlabs Espelho Thorlabs
1D Estágio Translacional	Thorlabs
Filtro de densidade neutra contínua	Thorlabs
Poste Pedestrial	Thorlabs
Garfo de fixação	Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube	Thorlabs
Adaptador	Thorlabs
Collimating Lens	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanômetro	Thorlabs
Relay Lens	Thorlabs	AC254-100-C	duas lentes de relé para fazer uma configuração de telescópio
Triângulo Espelho Montagem	Thorlabs
Espelho	Thorlabs
Objetivo	Mitutoyo
Pedestrial Post	Thorlabs
Garfo de Fixação	Thorlabs Controlador de Polarização Thorlabs
30mm Montagem em Gaiola	Thorlabs
Gaiola Rod	Thorlabs
Stage
3D motorizado estágio de tradução	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.
de rotação de estágio
	2D impresso em 3D
	Thorlabs	AC080-020-C
	G		= 1145 lpmm
F-theta	Thorlabs	FTH-1064-100
InGaAs Sensor de câmera de varredura de linha	Unlimited	SU1024-LDH2
Nome	Empresa	Número do catálogo	Comentários
Componente de cultura celular
HCT 116 Linha celular	ATCC	CCL-247
Frasco de cultura celular	SPL Life Sciences	70025
Pipeta	Fisherbrand	14388100
Ponteiras de pipeta	Sorenson Bioscience	10340
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Fetal Soro Bovino, certificado, origem americana	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Corning Microplaca de Fixação Ultrabaixa de Fundo Redondo Transparente de 96 poços	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Tripsina-EDTA (0,5%)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Série II 3110 Incubadoras de CO2 com camisa de água	Thermo Fisher Scientific	3120
Luvas	VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793
Pipetas de transferência	Globe Scientific	138080
Centrífuga	Eppendorf	5702 R	Para centrifugar o tubo de 15 mL
Centrífuga	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Para centrifugar o microscópio de placas de 96 poços
	Olympus
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Histologia & IHC
Scanner de lâminas digital	Leica	Aperio AT2	Obter imagens histológicas de alta resolução
Serviço	Histologia Histowiz		Solicitar serviço para coloração histológica e imuno-histológica de esferoides tumorais
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lista de PTU Comerciais
SD-OCT system	Thorlabs	Telesto Series
SD-OCT system	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comments
Software para análise de dados
Basic Image Analysis	NIH		ImageJ Fiji também funciona.
Renderização 3D	Thermo Fisher Scientific	Amira	Software comercial. Opção 1
Renderização 3D	Bitplane	Imaris	Software comercial. Opção 2. Utilizado no protocolo
OCT software			de aquisição desenvolvido sob medida em C++.
Controle de palco	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Incorporado ao código de aquisição de OCT personalizado
Software			desenvolvido em C++. Utilize GPU. Incorporado ao código de aquisição personalizado da OCT.
Análise Morfológica e Fisiológica			desenvolvida sob medida no MATLAB