JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık’dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Abstract

Tümör pulcuklarının üç boyutlu (3D) hücre kültür model kanser araştırma ve anti-kanser ilaç keşif olarak geliştirilmiştir. Ancak, şu anda, yüksek-den geçerek görüntüleme yöntemleri kullanan parlak alan veya floresan algılama, tümör küresel nedeniyle sınırlı ışık penetrasyon, difüzyon floresan boyalar ve genel olarak 3D yapısını çözümleyemediği ve Derinlik-resolvability. Son zamanlarda, bizim laboratuvar optik koherens tomografi (OCT), çok hücreli tümör pulcuklarının boyuna karakterizasyonu bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirmek için modality, Imaging 3D etiket içermeyen ve tahribatsız kullanımı gösterilmiştir. OCT yüksekliği yaklaşık 600 µm kadar büyüyen tümör pulcuklarının 3D morfolojik ve fizyolojik bilgi alma yeteneğine sahip. Bu makalede, tüm çok iyi plaka tarayan ve tümör pulcuklarının, 3D OCT verilerini otomatik olarak alır yüksek üretilen iş OCT (HT-Ekim) görüntüleme sistemi göstermektedir. Biz protokol HT-Ekim sistemi ve inşaat kurallarda ayrıntıları açıklamak. 3D OCT verilerden bir 3D render ile küresel genel yapısını görselleştirebilirsiniz ve ortogonal dilimleri, boyut ve hacim morfolojik bilgilere göre tümör küresel boyuna büyüme eğrisi karakterize ve gelişimini izlemek Optik içsel zayıflama Karşıtlık’göre tümör küresel ölü hücre bölgelerde. HT-Ekim için eleme yanı sıra biofabricated örnekleri karakterize uyuşturucu yüksek üretilen iş görüntüleme yöntemi kullanılabileceğini göstermektedir.

Introduction

Kanser Dünya1‘ deki ölüm ikinci önde gelen nedenidir. Kanser hedefleme uyuşturucu gelişmekte olan hastalar için çok önemli önem taşımaktadır. Ancak, bu yeni anti-kanser ilaçlar fazla % 90 etkinlik ve klinik çalışmalarda2beklenmedik toksisite eksikliği nedeniyle geliştirme aşamasında başarısız tahmin edilmektedir. Nedeni basit iki boyutlu (2D) hücre kültür modelleri kullanımını ilaç bulma2 aşağıdaki aşamaları için bileşik etkinlik ve toksisite sınırlı tahmini değerleri ile sonuçları sağlayan bileşik filtreleme için bağlanabilir , 3 , 4. son zamanlarda, üç boyutlu (3D) tümör küresel modelleri anti-kanser ilacı discovery3,4,5 için klinik fizyolojik ve farmakolojik veri sağlamak için geliştirilmiştir ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Beri bu pulcuklarının tümörler vivo içindedoku özgü özelliklerini taklit edebilen, besin ve oksijen gibi ilaç direnci19, bu modellerin kullanımı yanı sıra degrade, hipoksik çekirdek potansiyel olarak ilaç bulma zaman çizelgeleri kısaltabilir, yatırım maliyetleri azaltmak ve yeni ilaçlar hastalara daha etkili bir şekilde getir. 3D tümör küresel kalkınma bileşik etkinliğini değerlendirmek için bir kritik yaklaşım küresel büyüme ve yineleme tedaviler9,26altında izlemektir. Bunu yapmak için onun çapı ve hacmi, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri ile ilgili tümör morfolojisi nicel karakterizasyonu zorunludur.

Konvansiyonel görüntüleme yöntemleri, alan parlak, faz kontrast7,9,22,24ve floresan mikroskopi8,9,16gibi 18,22 küresel’ın çapı ölçüsü sağlayabilirsiniz ancak küresel 3B alanda genel yapısını çözümlenemiyor. Pek çok faktör penetrasyon problama ışığın içinde küresel dahil olmak üzere bu kısıtlamalar katkıda bulunmak; küresel içine floresan boyalar difüzyon; heyecanlı floresan boyalar içinde veya küresel güçlü emme ve saçılma nedeniyle ters yüzeyine flüoresan sinyalleri yayan; ve derinlik-resolvability bu yöntemleri görüntüleme. Bu kez bir yanlış cilt ölçüde yol açar. Pulcuklarının nekrotik çekirdek geliştirilmesi nekroz vivo içinde tümör6,10,15,19,25taklit eder. Bu patolojik özellik 2D hücre kültürleri19,25,27,28çoğaltılamaz düşüktür. Küresel boyutu 500 µm çapı, üç kat konsantrik yapısı, daha büyük olan Proliferasyona hücreler dış tabakası, orta tabaka deneniyor hücre ve nekrotik bir çekirdek, dahil olmak üzere küresel6‘,10 görülebilir ,15,19,25, oksijen ve besin yetersizliği nedeniyle. Canlı ve ölü hücre floresans görüntüleme nekrotik çekirdek sınırına etiketlemek için standart bir yaklaşımdır. Ancak, yine, bu floresan boyalar ve görünür ışık penetrations gerçek şeklini gelişimini izlemek için nekrotik çekirdek içine sonda potansiyeline engel.

Modalite Imaging alternatif bir 3D optik koherens tomografi (OCT) tümör pulcuklarının karakterize tanıştırdı. OCT ilâ etiket içermeyen, tahribatsız 3D verileri alınıyor kapasitesine sahip bir tekniktir Biyomedikal görüntüleme 1-2 mm biyolojik doku29,30,31,32,33 derinliklerinde ,34. OCT düşük tutarlılık Interferometry örnek farklı derinliklerinden gelen sinyalleri arka dağınık algılamak için kullanır ve yatay ve dikey yönlere mikron düzeyinde mekansal çözünürlükte yeniden oluşturulan derinlik çözüldü görüntüleri sağlar. OCT göz hastalıkları35,36,37 ve anjiyografi38,39yaygın olarak benimsemiştir. Önceki çalışmalarda OCT vitro morfolojisi tümör pulcuklarının membran matris (Örneğin, Matrigel) gözlemlemek ve fotodinamik tedavi40,41onların yanıtları değerlendirmek için kullandık. Son zamanlarda, bizim grup sistematik olarak izlemek ve çok iyi plakaları423D tümör pulcuklarının büyüme kinetik ölçmek için bir yüksek-den geçerek OCT görüntüleme platformu kuruldu. Yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık’dayalı pulcuklarının etiket içermeyen nekrotik doku algılama sayma Voksel kullanarak 3D tümör pulcuklarının kesin hacimsel miktar gösterdi. Bu yazıda nasıl OCT görüntüleme platformu inşa ve tümör pulcuklarının yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntüleri elde etmek için istihdam ayrıntılarını açıklar. Büyüme kinetik 3D tümör pulcuklarının, küresel çapı ve birimlerin, doğru ölçümler de dahil olmak üzere, adım adım kantitatif analiz konusunda açıklanmıştır. Ayrıca, içsel optik zayıflama Karşıtlık’dayalı EKM kullanarak nekrotik doku bölgeleri tahribatsız algılama yöntemi gösterilir.

Protocol

1. hücre hazırlanması Hücre hatları nitelikli bir tedarikçiden edinin.Not: hücreleri ilgi hücre satırlarından küresel kültür ortamda veya bir substrat (Matrigel gibi membran matris) yardımıyla oluşturabilir doğrulayın. Bir tur öncesi bir deneme için bir denetimi gerçekleştirmek ya da edebiyat9 içine bak. Aşağıdaki hücre kültürünü tedarikçi tarafından sağlanan belirli yordamı donmuş hücreleri çözülme. Genel yordam43</…

Representative Results

Yüksek işlem hacmi optik koherens tomografi görüntüleme pulcuklarının bir 96-şey plaka Şekil 3 gün 3 HCT 116 tümör pulcuklarının 96-şey plakalı HT-Ekim tarama sonucu sergiler. Koca tabağı sıralı tarama (H12) sağ alt kuyudan başlar. Şekil 3B HT-Ekim sisteminin yazılım uygulama Akış grafiğini gösterir. Bir küresel veriler toplanır ve işlenen s…

Discussion

Tümör faaliyet morfolojik yapısı için son derece uygundur. Karakteristik büyüme eğrisi 2D hücre kültürleri için izleme, izleme için 3D tümör pulcuklarının büyüme eğrisi de uzun vadeli küresel büyüme davranış farklı hücre hatları için karakterize etmek için geleneksel bir yaklaşım benzer. Özellikle, biz tümör bozulma ya da doğrudan büyüme eğrisi yansır tümör büyütme analiz ederek uyuşturucu yanıt karakterize olabilir. Bu nedenle, boyutu ve büyüme eğrisi türetmek için ses …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NSF tarafından desteklenen IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR verir-TT (dudak-1640707), NIH hibe R21EY026380, R15EB019704 ve R01EB025209 ve Lehigh Üniversitesi başlangıç fonu.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  2. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  3. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  4. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  5. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  6. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  7. Tung, Y. -. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  8. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  9. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  10. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  11. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  12. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  13. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  14. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  15. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
  16. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  17. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  18. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  19. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  20. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  21. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
  22. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  23. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  24. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  26. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  27. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  28. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  29. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
  30. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), (2016).
  31. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  32. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  33. Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical coherence tomography: technology and applications. , (2008).
  34. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
  35. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve – a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  36. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  37. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  38. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
  39. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  40. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  41. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Pesquisa do Câncer. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  42. Spalteholz, W. . Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , (1911).
  43. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
  44. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  45. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. . Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , 85710Z (2013).
  46. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  47. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  48. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  49. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  50. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  51. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Tags

Keywords: 3D Tumor SpheroidsOptical Coherence Tomography3D Cell CultureAnti-cancer Drug DiscoveryCell SeedingCell SuspensionUltra-low Attachment PlateCentrifugationCell ConcentrationCell MonitoringIncubationMedium RefreshOCT System Construction
check_url/pt/59020?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image