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Pesquisa do Câncer

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

Abstract

종양 spheroids 암 연구 및 항 암 신약의 3 차원 (3D) 세포 문화 모델 개발 되었습니다. 그러나, 현재, 높은 처리량 modalities 이미징 밝은 필드 또는 형광 탐지를 활용 하 여 수 없습니다 제한 된 빛이 침투, 형광 염료의 확산으로 인해 종양 회전 타원 체의 전반적인 3D 구조를 해결 하 고 깊이-resolvability. 최근, 우리 실험실 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 레이블 및 비 파괴적인 3D 96 잘 접시에 다세포 종양 spheroids의 경도 특성 분석을 수행 하려면 양식 적임 이미징의 사용을 시연 했다. 10 월은 높이 약 600 µ m까지 성장 하는 종양 spheroids의 3D 형태학 상과 생리 적인 정보를 얻는 능력. 이 문서에서는, 높은 처리량 (HT-10 월) 10 월 이미징 시스템을 전체 다 잘 판 검사 및 종양 spheroids의 3D 10 월 데이터를 자동으로 가져옵니다 설명 합니다. 프로토콜에 HT-10 월 시스템 및 건설 지침의 세부 사항을 설명합니다. 3D 10 월 데이터에서 하나 3d 렌더링은 회전 타원 체의 전체 구조를 시각화할 수 및 직교 분할 영역 크기와 볼륨의 형태학 정보에 따라 종양 회전 타원 체의 경도 성장 곡선을 특성화 고의 성장 모니터링 광학 내장 감쇄 대비에 따라 종양 회전 타원 체에 죽은 셀 영역입니다. 우리는 약물 검사로 biofabricated 샘플을 특성화에 대 한 HT-10 월에는 높은 처리량 이미징 형식으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

Introduction

암은 세계1죽음의 두 번째 주요 원인. 암을 대상으로 하는 약물을 개발 하는 것은 환자에 대 한 중요 한 중요성 의입니다. 그러나, 그것은 새로운 항 암 약의 90% 이상 효능과 임상 실험2에서 예기치 않은 독성의 부족 때문에 개발 단계에서 실패 추정. 이유의 일부는 약 발견2 의 다음 단계에 대 한 복합 효능 및 독성의 예측 값이 제한 된 결과 제공 하는 복합 심사에 대 한 간단한 2 차원 (2D) 세포 문화 모델의 사용에 표시 될 수 있습니다. , 3 , 4. 최근 3 차원 (3D) 종양 회전 타원 체 모델 항 암 약물 발견3,,45 에 대 한 임상 관련 생리 및 약리 데이터를 제공 하도록 개발 되었습니다 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24,25. 때문에 이러한 spheroids 종양에서 vivo에서의 조직-특정 속성을 흉내낼 수 있다, 영양소와 산소 등 약물 저항19를 이러한 모델의 사용 뿐만 아니라 그라데이션, hypoxic 코어 수 잠재적으로 단축 약물 발견 타임 라인, 투자 비용을 절감 하 고 보다 효과적으로 환자에 게 신약을가지고. 중요 한 방법 중 하나 3D 종양 회전 타원 체 개발에 복합 효능 평가 모니터링 회전 타원 체 성장과 재발 치료9,26에서 것입니다. 이렇게 종양 형태, 그것의 직경 및 고해상도 이미징 형식으로 볼륨의 양적 characterizations 필수적입니다.

밝은 분야, 위상 대비7,9,,2224, 형광 현미경 검사 법8,,916, 등 기존의 이미징 형식 18,22 회전 타원 체의 직경의 측정을 제공할 수 있지만 3 차원 공간에서 회전 타원 체의 전체 구조를 확인할 수 없습니다. 회전 타원 체; 프로브 빛의 침투를 포함 하 여 이러한 제한에 기여 하는 많은 요인 회전 타원 체;에 형광 염료의 확산 내부 또는 강한 흡수 및 산란; 회전 타원 체의 반대 표면에 흥분된 형광 염료에서 발광 형광 신호 그리고 이러한 깊이 resolvability 이미징 형식. 이 종종 부정확 한 볼륨 측정 리드. Spheroids에서 괴 사 성 코어의 개발 vivo에서 종양6,10,15,,1925괴 사를 모방합니다. 이 병 적인 특징은 2D 셀 문화19,25,,2728에서 가능성이. 500 µ m 직경, 3 층 동심 구조 보다는 더 큰 회전 타원 체 크기와 증식 세포의 외부 층, 무부하 셀, 중간 계층 및 회 저 성 코어를 포함 하 여 관찰 될 수 있다 회전 타원 체6,10 ,15,,1925, 산소와 영양분의 부족으로 인해. 라이브 및 죽은 세포 형광 이미징 괴 코어의 경계를 접근 하는 표준 방식입니다. 그러나, 다시,이 형광 염료와 가시광선의 침투의 실제 형태로 개발 모니터링 하 괴 코어로 검색을 방해.

대체 3D 적임 이미징, 종양 spheroids 하 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 도입 되었습니다. 10 월은 수 있는 레이블 무료, 비-파괴적인 3D 데이터에서 최대 바이오 메디컬 이미징 기술 1-2 mm 깊이 생물 조직29,30,31,,3233 34. 10 월 샘플의 다른 깊이에서 다시 흩어져 신호 낮은 일관성 간섭계를 사용 하 여 고 가로 세로 방향에서 마이크론 수준의 공간 해상도에서 재건된 깊이 해결 이미지를 제공 합니다. 10 월 안과35,,3637 그리고 제품은38,39에 널리 채택 되었습니다. 이전 연구는 관찰 하 생체 외에서 의 형태 (예를 들어, Matrigel) 지하실 멤브레인 매트릭스에 종양 spheroids 고 photodynamic 치료40,41에 대 한 그들의 응답을 평가 10 월을 사용 했습니다. 최근, 우리의 그룹 체계적으로 모니터링 하 고 다 잘 플레이트42에 3D 종양 spheroids의 성장 활동을 계량 높은 처리량 10 월 영상 플랫폼을 설립. 접근 및 레이블 없는 괴 사 성 조직 감지 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 복을 사용 하 여 3D 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다. 이 종이 어떻게 OCT 영상 플랫폼 건설 되었고 종양 spheroids의 고해상도 3D 이미지를 고용의 세부 사항을 설명 합니다. 회전 타원 체 직경 및 볼륨의 정확한 측정을 포함 하 여 3 차원 종양 spheroids의 성장 활동의 단계별 정량 분석은 기술 된다. 또한, 내장 광 감쇠 대비에 따라 OCT를 사용 하 여 괴 사 성 조직 영역의 비파괴 탐지의 방법은 제공 됩니다.

Protocol

1입니다. 셀의 준비 자격 갖춘된 공급 업체에서 셀 라인을 얻을.참고: 셀의 셀 라인에서 문화 미디어 또는 기판 (Matrigel 같은 지하실 막 매트릭스)의 도움으로 회전 타원 체를 형성할 수 있다 확인 하십시오. 9 문학 또는 검사에 대 한 사전 실험의 한 라운드를 수행. 셀 라인 공급 업체에서 제공 하는 특정 절차에 따라 냉동된 셀 동 일반 절차 다른43을<…

Representative Results

96 잘 접시에 Spheroids의 높은 처리량 광학 일관성 단층 촬영 화상 진 찰 그림 3 HT-10 월 3 일에 HCT 116 종양 spheroids 96 잘 접시의 검사의 결과 전시 한다. 전체 접시의 순차 스캔 오른쪽 아래 우물 (H12)에서 시작합니다. 그림 3B HT-10 월 시스템의 소프트웨어 구현에 대 한 흐름 차트가 표시 됩?…

Discussion

종양 활동은 매우 그것의 형태학 상 구조에 관련이 있다. 유사한 특성 성장 곡선 2D 셀 문화에 대 한 모니터링, 3D 종양 spheroids에 대 한 성장 곡선을 추적 이다 또한 다른 세포에 대 한 장기적인 회전 타원 체 성장 동작에 대 한 기존의 접근. 특히, 우리 종양 저하 또는 직접 성장 곡선에 반영 하는 종양 재 성장을 분석 하 여 약물 응답을 특징 수 있습니다. 따라서, 3 차원 종양 spheroids, 크기, 볼륨, 성장…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NSF에 의해 지원 되었다 IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR를 부여-TT (IIP-1640707), NIH 교부 금, R21EY026380, R01EB025209, R15EB019704 및 Lehigh 대학 시작 기금.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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Referências

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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
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