Оптическая когерентная томография (Окт), трехмерные технологии визуализации, был использован для мониторинга и характеризуют Кинетика роста многоклеточных опухоли сфероидов. Точные объемного количественной сфероидов опухоли с помощью voxel, считая подход и обнаружения метки бесплатно мертвых тканей в сфероидов, основанные на встроенных оптического затухания контраст, были продемонстрированы.
Опухоль сфероидов были разработаны как модель трехмерной (3D) клетки культуры в раковых исследований и противораковых лекарств. Однако, в настоящее время, высок объём визуализации формы используя яркие поля или флуоресценции обнаружения, не удастся разрешить в целом 3D структура сфероида опухоль из-за ограниченной проникновение света, диффузии флуоресцентных красителей и Глубина растворимость. Недавно Наша лаборатория продемонстрировали использование оптическая когерентная томография (Окт), этикетка свободно и неразрушающего 3D визуализации модальности, для выполнения продольной характеристика сфероидов многоклеточных опухоли в 96-луночных пластине. Октябрь был способен получения 3D морфологических и физиологических информации сфероидов опухоли расти до около 600 мкм в высоту. В этой статье мы демонстрируем высок объём OCT (HT-Окт) изображения системы, которая сканирует весь несколькими хорошо пластины и автоматически получает 3D данные OCT опухоли сфероидов. Мы описываем подробности руководящих принципов системы и строительство HT-Сен, в протоколе. С 3D данных OCT один можно визуализировать в общей структуре сфероида с 3D визуализации и ортогональных срезов, характеризуют кривой продольного роста опухоли сфероида основе морфологических информации, размер и объем и контролировать рост регионах мертвых клеток в опухоли сфероида, основанный на контраст оптических встроенные затухания. Мы покажем, что HT-Окт может использоваться как механизм визуализации высокой пропускной способностью для наркотиков скрининг, а также охарактеризовав biofabricated образцов.
Рак является второй ведущей причиной смерти в мире-1. Разработки лекарств против рака имеет решающее значение для пациентов. Однако предполагается, что более 90% новых противораковых препаратов не в фазе развития ввиду отсутствия эффективности и неожиданные токсичности в клинических испытаниях2. Часть причины можно объяснить использование простой двухмерный (2D) клетки культуры моделей для составных скрининга, которые обеспечивают результаты с ограниченным предсказательная ценность составных эффективности и токсичности для следующих этапов обнаружения наркотиков2 , 3 , 4. Недавно, трехмерные (3D) опухоли сфероида модели были разработаны предоставлять клинически соответствующие физиологические и фармакологические данные для борьбы против рака наркотиков обнаружения3,4,5 ,6,,78,9,10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19,20,21,,2223, 24,25. Поскольку эти сфероидов могут имитировать ткани специфические свойства опухоли в естественных условиях, например, питательных веществ и кислорода градиента, гипоксических ядро, а также наркотиков сопротивления19, использование этих моделей потенциально может сократить сроки обнаружения наркотиков, снизить затраты на инвестиции и принести новые медикаменты пациентам более эффективно. Один критический подход к оценке составные эффективность развития сфероида 3D опухоли является мониторинг сфероида роста и возобновления под лечения9,26. Для этого необходимы количественные характеристики опухоли морфологии, его диаметр и объем, с высоким разрешением изображения формы.
Обычных изображений условия, например, ярко поле, фаза контраст7,9,,2224и флуоресцентной микроскопии8,9,16, 18,22 может обеспечить измерение диаметра сфероида, но не может решить общую структуру сфероида в трехмерном пространстве. Многие факторы способствуют этих ограничений, в том числе проникновения зондирующего света в сфероида; Диффузия флуоресцентных красителей в сфероида; Флуоресцентный радиосигналов от возбужденных флуоресцентных красителей внутри или на поверхности противоположной сфероида из-за сильного поглощения и рассеяния; и глубина растворимость этих изображений условий. Это часто приводит к неточным объем измерений. Развитие некротические ядра в сфероидов имитирует некроза в в естественных условиях опухоли6,10,15,19,25. Эта функция патологических маловероятно, воспроизведены в 2D клетки культуры19,25,27,28. С сфероида размером более 500 мкм в диаметре, трехслойные концентрических структуры, включая внешний слой пролиферирующих клеток, средний слой покоя клеток и некротические ядро, можно наблюдать в сфероида6,10 ,15,19,25, из-за недостатка кислорода и питательных веществ. Живые и мертвые клетки флуоресценции изображений является стандартный подход к этикетке границы некротические ядра. Однако опять же, проникновение этих флуоресцентных красителей и видимого света препятствуют потенциал для зонда в ядро некротические контролировать свое развитие в его фактической формы.
Альтернативные 3D визуализации модальности, оптическая когерентная томография (Окт) вводится для характеристики опухоли сфероидов. Октябрь является биомедицинских изображений техники, которая способна до приобретения лейбл бесплатно, неразрушающего 3D данные из 1-2 мм глубины в биологических тканях29,30,,3132,33 ,34. Окт использует низкий согласованности интерферометрии для обнаружения обратно рассеянном сигналы с разных глубин образца и обеспечивает реконструированный решена глубины изображения на микрон уровня пространственного разрешения в боковых и вертикальном направлениях. Окт была широко принята в офтальмологии35,,3637 и ангиографии38,39. Предыдущие исследования использовали OCT наблюдать морфология в vitro сфероидов опухоли базальной мембраны матрицы (например, Matrigel) и оценить их ответы для фотодинамической терапии40,41. Недавно наша группа создана высок объём OCT изображений платформы для систематического мониторинга и количественной оценки Кинетика роста сфероидов 3D опухоли в нескольких хорошо плиты42. Были продемонстрированы точные объемного количественной сфероидов 3D опухоли с помощью voxel, считая подход и обнаружения метки бесплатно некротических тканей в сфероидов, основанные на встроенных оптического затухания контраст. Этот документ описывает детали как платформа отображения информации октября была построена и используемых для получения изображений с высоким разрешением 3D из опухоли сфероидов. Шаг за шагом количественный анализ кинетики роста сфероидов 3D опухоли, включая точные измерения диаметра сфероида и томов, описан. Кроме того представлен метод неразрушающего обнаружения областей некротических тканей с помощью OCT, основанные на встроенных оптического затухания контраст.
Опухоли деятельности является весьма актуальным для ее морфологической структуры. Аналогичные наблюдения кривой роста характерные для 2D клеточных культур, отслеживание кривая роста для 3D опухоли сфероидов является также традиционный подход к характеризуют долгосрочное сфероида ро?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NSF предоставляет мкр (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (МИП-1640707), низ грантов, R21EY026380, R15EB019704 и R01EB025209 и университете Лихай запуска фонда.
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |