Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie
Summary
Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.
Abstract
Überwältigend Gewebe Ansammlung von hoch aktivierten Immunzellen ist ein Markenzeichen der verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten und erwies sich als ein attraktives therapeutische Ziel in die klinische Behandlung der betroffenen Patienten. Um Strategien zur therapeutischen Regulierung der pathologisch unausgewogen Gewebe eindringen von Pro-inflammatorischen Immunzellen weiter zu optimieren, wird es von besonderer Bedeutung für bessere Einblicke in Krankheit und organspezifischen zu erreichen sein. Homing Eigenschaften des peripheren Lymphozyten. Die hier beschriebenen experimentelle Protokoll ermöglicht, um Lunge Anhäufung von Eindringmittel beschriftet und adoptively übertragenen menschlichen Lymphozyten im Zusammenhang mit Papain-induzierten Lungenentzündung zu überwachen. Die jetzt eingeführte in-vivo-Einstellung berücksichtigt im Gegensatz zum standard in-vitro-Untersuchungen häufig verwendet für die Analyse der Immunzelle Migration und Chemotaxis Lunge-spezifische Aspekte der Gewebe-Organisation und der Einfluss des Komplexes entzündliche Szenario in murinen Lebewesen stattfindet. Darüber hinaus dreidimensionale Cross-sectional Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung bietet nicht nur quantitative Daten an Immunzellen zu infiltrieren, sondern zeigt auch das Muster der Immunzelle Lokalisierung innerhalb der entzündeten Lunge. Insgesamt sind wir in der Lage, eine innovative Technik von hohem Wert für die immunologische Forschung auf dem Gebiet der chronisch entzündlichen Lungenerkrankungen, einzuführen, die leicht anhand der zur Verfügung gestellten schrittweise Protokoll angewendet werden können.
Introduction
Klassische entzündliche Erkrankungen der Lunge, wie allergisches Asthma und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) sind bekannt durch eine verstärkte Rekrutierung von aktivierten Lymphozyten in der pulmonalen Gewebe1,2getrieben werden. Lymphozyten freigegeben Zytokine (z.B. IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ und TNF-α) fördern Chemotaxis von angeborenen und der adaptiven Immunzellen, induzieren fibrotische Atemwege Umbau oder direkt schädigen die Lunge Parenchym2. Bisher sind verantwortlich für die pathologische Ansammlung von Lymphozyten im Lungengewebe zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig verstanden. In Analogie zur Gewebe-selektive T-Zell-Prägung für Darm und Haut Homing beschrieben, pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind offensichtlich in der Lage, auf peripheren T-Zellen für bevorzugte Lung Infiltration, zumindest teilweise über die Induktion von CCR4 Ausdruck prime die Oberfläche von Lymphozyten3. Neben CCR4 zeichnen sich die Atemwege infiltrieren T-Zellen auch durch einen besonders erhöhten Ausdruck der Chemokin-Rezeptoren CCR5 und CXCR3 im Vergleich zu T-Zellen im peripheren Blut1,4,5. Insgesamt, vorhandene Daten stehen im Einklang mit dem Konzept, dass Lungenkrebs Homing von T-Lymphozyten unter physiologischen oder entzündlichen Bedingungen eine Reihe von verschiedenen Chemokin-Rezeptoren und ihrer jeweiligen Liganden beinhaltet und somit entscheidend abhängig ein eng Zusammenarbeit zwischen angeborenen und der adaptiven Immunzellen1gesteuert. Vor allem in der Anfangsphase der Erreger oder Allergen-Exposition reagieren Zellen des angeborenen Immunsystems TLR Stimulation oder IgE-vermittelten Vernetzung durch die sofortige Freilassung von verschiedenen Chemoattractants wie LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 und PID21,6,7. Als Paradebeispiel das Zusammenspiel von PID2 und der Lockstoffgradient-Rezeptor CRTh2 ist bekannt, dass für Chemotaxis von Th2-Zellen von besonderer Bedeutung und so erschien als vielversprechende therapeutische Ziel in die klinische Behandlung von Asthma. In der Tat zeigten Patienten mit moderaten Asthma eine Besserung der Symptome und eine deutliche Zunahme der erzwungenen exspiratorischen Volumen in einer Sekunde (FEV1) nach der Behandlung mit einem selektiven CRTh2-Antagonisten im Vergleich zu der Placebo-Gruppe8 ,9. Bereits rekrutierte T-Zellen können in einem mehr fortgeschrittenen Zustand der Entzündungsreaktion pulmonale Lymphozyten Akkumulation über die Freisetzung von IL-4 und IL-13 als potenter Stimulus für pulmonale DCs weiter verstärken. Anschließend, Regeln bis-diese myeloische abgeleitet angeborene Zellen die Expression von CCL17 und CCL22 in einem STAT6-abhängigen Weise1,10,11. Obwohl die Komplexität des beschriebenen Szenarios noch ein vollständiges Verständnis der T-Zell-Lunge homing behindert, bietet es eine Fülle von molekularen Zielstrukturen für eine potenziell optimierte therapeutische Kontrolle der entzündliche oder allergische Lungenerkrankungen. Daher ist dringend innovative experimentelle Techniken, die sind in der Lage weiter zu vertiefen und ergänzen unser Wissen im Bereich der T-Zell-Chemotaxis und Lunge Homing.
Die Lunge Homing von Lymphozyten innerhalb des menschlichen Körpers durch mehrere zelluläre und humorale körperliche Parameter1beeinflusst wird, sind die meisten der vorhandenen experimentellen Methoden nicht in der Lage, die ganze Komplexität dieser immunologischen Prozess zu modellieren. Stattdessen konzentrieren sich viele standard-Protokolle für die Analyse der Lunge homing selektiv auf einen bestimmten Aspekt der Kaskade von Lymphozyten Attraktion, Adhäsion, Migration und Aufbewahrung beteiligt. Neben einer rein beschreibenden Bestimmung der mRNA oder Protein Expressionsmuster der Integrine und Chemokin-Rezeptoren auf periphere oder Lunge infiltrieren Lymphozyten und die ergänzende Messung des jeweiligen Chemokin-Spiegel im Blut, alvéolaire Lavage (BAL) oder pulmonale Gewebe12,13,14,15, etablierten in-vitro-Zelle-Kultur-Assays ermöglichen eine funktionelle Charakterisierung von Lymphozyten Haftung oder chemotaxis nach definierten Versuchsbedingungen16,17,18. Im Prinzip überwachen statische Haftung in-vitro-Tests die Bindungskapazität von kultivierten Lymphozyten eine endotheliale Monolage oder Glas-Objektträger beschichtet mit rekombinanten endothelialen Adhäsionsmoleküle (z. B. MAdCAM-1, VCAM-1), während der Standard in-vitro- Chemotaxis-Assays sind in der Regel angewendet, um die Fähigkeit von Lymphozyten, entlang eines Chemokin-Gradienten in ein Transwell System19migrieren zu quantifizieren. Sowohl in-vitro-Einstellungen ermöglichen eine kontrollierte Anpassung und Modulation der experimentellen Bedingungen, aber auf der anderen Seite fehlen wichtige Variablen, die bekanntermaßen kritisch Einfluss auf in-vivo Chemotaxis und Adhäsion von Lymphozyten. Überwiegend statische Zelle Kultur Assays missachten den Einfluss von Scherkräften verursacht durch die permanente Blut fließen19 und potenziell vernachlässigen die Einbeziehung der umliegenden immunologische Milieu und interagierenden-Lymphozyten Immunzellen, die beiden präsentieren in einem lebenden Organismus. Um diese Einschränkungen zu überwinden, die Interpretation der Ergebnisse erwarb statische in-vitro-Chemotaxis oder die Einhaltung von Untersuchungen benötigen weitere Validierung in dynamischen Adhäsion Experimente unter Strömung Bedingungen20,21 und in in Vivo Modelle von entzündlichen Orgel Pathologie19. In der Tat geändert wichtige Rückschlüsse auf die Regulierung der T-Zell-Lunge homing entzündliche oder allergische Bedingungen aus tierexperimentellen Studien gezogen werden könnten genetisch Analyse Mäuse in definierten Modelle von verschiedenen Lungenkrankheiten3, 22 , 23. der quantitativen Vergleich der Lunge infiltrieren Lymphozyten zwischen Wildtyp-Mäusen und Mäuse mit einem Mangel, denn ein bestimmtes Gen des Interesses, eine etablierte und allgemein verwendete Werkzeug zur Definition der Auswirkungen von bestimmten Mobilfunk dar Wege oder auf die Erkrankung ausgerichtete Verteilungsmuster T-Zell-Rezeptoren. Jedoch fehlt im Gegensatz zu vor in-vitro-Zelle-Kultur-Assays, diskutiert ein Studiendesign, basierend auf klassischen Tiermodellen die Möglichkeit, analysieren und überwachen der primären menschlichen T-Zellen direkt abgeleitet aus dem Blut oder BAL von Patienten mit einer entzündlichen Lunge Erkrankung. Somit bleibt es weiterhin schwierig, funktional zu überprüfen, ob eine diagnostisch angegebenen Lungenerkrankung ist in der Lage, Impressum menschliche Lymphozyten für bevorzugte Lunge Tropismus und wie weit klinische Parameter auf dieses Szenario auswirken könnte. Vor kurzem wurde ein sehr eleganter in-vivo-Ansatz im Zusammenhang mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) eingeführt, die war in der Lage, die meisten dieser Einschränkungen zu überwinden und eröffnet neue Wege für die translationale Hauptstudium am Darm Lymphozyten homing24 . Unter Ausnutzung der Protokolle für lösemittelhaltige Gewebe Clearing gefolgt von Cross-sectional Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie als eine leistungsfähige imaging-Tool, war es möglich, die Infiltration und die Verteilung der adoptively übertragenen menschlichen T-Zellen visualisieren im Darm von colitic immungeschwächte Mäuse24. Insbesondere diese experimentelle Einstellung implementiert zwei wesentliche Neuerungen: (1) primäre menschliche Immunzellen analysiert werden können, unter experimentell definierten in vivo Bedingungen; (2) eine ziemlich große Fläche des erkrankten Organs (ca. 1,5 x 1,5 cm) in hochauflösender Qualität, gefolgt von 3D-Rekonstruktion abgebildet werden können. Darüber hinaus stellte mehrere neuere Studien erfolgreich die Verwendung von lösungsmittelhaltigen Gewebe clearing und Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie als wichtige Werkzeuge für die fortgeschrittenen Lungenkrebs imaging25,26. Um von diesem technologischen Fortschritt auf dem Gebiet der pulmonalen Immunologie zu profitieren, haben wir nun das System für die Analyse der Lunge Homing angenommen.
Die hier vorgestellte Protokoll bietet einer schrittweisen Einführung wie zu reinigen und Eindringmittel Label primären menschlichen T-Zellen für den Transfer in Mäusen mit induzierten Lungenentzündung und darüber hinaus beschreibt im Detail den nachfolgenden Prozess der Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung, einschließlich Orgel Vorbereitung und Bildverarbeitung. Alles in allem hoffen wir, künftige translationale Studien auf dem Gebiet der entzündlichen oder allergischen Lungenerkrankungen zu unterstützen, durch die Einführung einer anspruchsvollen, aber dennoch machbar, experimentellen Modell für die Überwachung der menschlichen Lymphozyten Lunge Homing auf in-vivo-Bedingungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen experimentellen Einstellung bietet die Möglichkeit, homing Lungenkapazität von primären menschlichen Immunzellen unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen und damit einschlägig ergänzt klassisch überwachen in-vitro-Adhäsion und Chemotaxis durchgeführt Assays. Um die Berücksichtigung der spezifischen anatomischen Organ Merkmale der Lunge zu berücksichtigen, haben wir wichtige Aspekte der Immunzelle homing (einschließlich Chemotaxis und Zelle Verteilung in das …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen dankbar, Förderung durch die DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 und TRR 241. Die Optical Imaging Zentrum Erlangen (Hauptsitz) und in bestimmten Ralf Palmisano, Philipp Tripal und Tina Fraaß (Projekt Z2 der DFG SFB 1181) sind anerkannt für kompetente technische Unterstützung für die Licht-Blatt Fluoreszenz mikroskopische Bildgebung.
Materials
| Agarose NEEO Ultra | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2267.4 | |
| AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody | BioLegend, San Diego, USA | 304060 | |
| Ammonium chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | K2981 | |
| Cannula 21 G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 301300 | |
| Cell proliferation dye eflour670 | eBioscience Inc., San Diego, USA | 65-0840-85 | |
| CD4 MicroBeads, human | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-045-101 | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 8043.1 | |
| Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 21066001 | |
| Ethly cinnamate (ECi) | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | 112372-100G | |
| Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5054.3 | |
| FBS (fetal bovine serum) Good Forte | PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany | P40-47500 | |
| Filter 100 µm | VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany | 732-2758 | |
| Imaris Image Analysis Software 9.0.2 | Bitplane AG, Zurich, Switzerland | n.a. | |
| ImspectorPro software | Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany | n.a. | |
| Ketamin | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | 3617KET-V | |
| LaVision UltraMicroscope II | LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany | n.a. | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
| Multifly cannula 20 G | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 851638035 | |
| 30 G needle | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9161502 | |
| Neubauer counting chamber | neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | C-1003 | |
| Pattex Glue | Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany | PSK1C | |
| LS column | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-042-401 | |
| Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) | anprotec | AC-AF-0018 | |
| RPMI medium | (Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| Papain | Merck | 1,071,440,025 | |
| PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | L182-10 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 | BioLegend, San Diego, USA | 317428 | |
| PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl | BioLegend, San Diego, USA | 400337 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0335.1 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | P7481 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 86.1254.001 | |
| Syringe 1 ml | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany | 9166017V | |
| Syringe 5 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260067 | |
| Syringe 20 ml | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA | 260069 | |
| Tube 1.5 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,706,400 | |
| Tube 2 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72.695.400 | |
| Tube 2 ml, brown | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 72,695,001 | |
| Tube 15 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.554.502 | |
| Tube 50 ml | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62.547.254 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany | 130-090-976 | |
| Xylazin (Rompun 2%) | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | KPOBD32 |
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