Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Summary

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Abstract

Acumulación de tejido de células inmunitarias altamente activadas representa un sello de varias enfermedades inflamatorias crónicas y surgió como una diana terapéutica atractiva en el manejo clínico de los pacientes afectados. Para optimizar aún más estrategias con el objetivo de la regulación terapéutica de infiltración de tejido patológicamente desequilibrada de células inmunológicas inflamatorias, será de particular importancia para el logro de mejores perspectivas en enfermedades órgano-específicas y propiedades homing de linfocitos periféricos. El protocolo experimental descrito aquí permite para vigilar acumulación pulmonar de fluorescencia etiquetadas y eventualmente transferidos los linfocitos humanos en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por la papaína. En contraste con estudios in vitro estándar utilizadas para el análisis de la migración de células inmunes y quimiotaxis, la configuración en vivo ahora introducida tiene en cuenta los aspectos pulmonar específico de organización tejido y la influencia del complejo inflamatorio escenario tiene lugar en el organismo murino vivo. Por otra parte, la proyección de imagen microscópica tridimensional transversal hoja de luz fluorescencia no sólo proporciona datos cuantitativos sobre las células inmunes de la infiltración, pero también representa el patrón de localización de células inmunitarias en el pulmón inflamado. En general, somos capaces de introducir una técnica innovadora de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que pueden aplicarse fácilmente siguiendo el protocolo paso a paso siempre.

Introduction

Trastornos inflamatorios clásicos del pulmón, como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), son bien conocidos para ser conducido por un mayor reclutamiento de linfocitos activados en el tejido pulmonar^1,2. Publicado por linfocitos citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ y TNF-α) promover aún más la Quimiotaxis de las células inmunes innatas y adaptativas, inducen remodelación fibrótica de la vía aérea o directamente dañar el parénquima de pulmón². Hasta ahora, los mecanismos subyacentes responsables de la acumulación patológica de linfocitos en el tejido pulmonar no se entiende todavía completamente. En analogía a impresión selectiva para el tejido T cell descrita homing de intestino y piel, pulmonares células dendríticas (DCs) son obviamente capaces de cebar células de T periféricas para infiltración de pulmón preferenciales, al menos en parte mediante la inducción de la expresión de CCR4 en la superficie de los linfocitos³. Además de CCR4, las células T infiltrantes en las vías respiratorias también se caracterizan por un especial incremento en la expresión de los receptores del chemokine CCR5 y CXCR3 en comparación con las células de T en la sangre periférica^1,4,5. En generales, los datos son consistentes con el concepto que autoguiado hacia el blanco de los linfocitos T en condiciones fisiológicas o inflamatorias del pulmón consiste en un número de diferentes chemokine receptores y sus ligandos respectivos y así crucial depende de una estrecha colaboración control de colaboración entre las células inmunes innata y adaptativa¹. Especialmente, durante la fase inicial de la exposición de patógenos o alérgenos, células del sistema inmune innato responden al estímulo de TLR o IgE-mediada del cross-linking de la liberación inmediata de los diferentes atrayentes, como el LTB₄, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 y PGD₂^1,6,7. Como un ejemplo, la interacción entre PGD₂ y el receptor chemoattractant CRTh2 es conocido por ser de particular importancia para el quimiotactismo de las células Th2 y así apareció como prometedora diana terapéutica en el manejo clínico del asma. De hecho, pacientes con asma moderada mostraron una mejoría de los síntomas y un aumento significativo del volumen espiratorio forzado en un segundo (VEF₁) después del tratamiento con un antagonista selectivo de CRTh2 en comparación con el placebo grupo^{8 ,9}. En un estado más progresado de la respuesta inflamatoria, ya reclutado de las células T son capaces de amplificar más acumulación de linfocitos pulmonares mediante la liberación de IL-4 y IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, estas células mieloides derivados de innatas para arriba-regulan la expresión de CCL17 y CCL22 en un dependiente de STAT6 forma^1,10,11.  Aunque la complejidad de la situación descrita todavía impide una comprensión completa del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco, ofrece una gran cantidad de dianas moleculares para un control terapéutico potencialmente optimizado de enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de innovadoras técnicas experimentales, que son capaces de profundizar y complementar nuestro conocimiento en el campo de la Quimiotaxis de células T y homing de pulmón.

Debido a que homing pulmón de linfocitos en el cuerpo humano está influenciada por varios parámetros celulares, humorales y física¹, la mayoría de los métodos experimentales existentes no es capaces de modelar la entera complejidad de este proceso inmunológico. En cambio, muchos protocolos estándar para el análisis de pulmón homing selectivamente se centran en un aspecto específico en la cascada de linfocito atracción, adhesión, migración y retención. Además de una determinación puramente descriptiva del patrón de expresión de mRNA o proteínas de receptores de integrinas y quimioquinas en linfocitos periféricos o infiltración pulmonar y la medida complementaria de chemokine respectivos niveles en sangre, el lavado broncoalveolar (BAL) o tejido pulmonar^12,13,14,15, celular in vitro bien establecida cultura ensayos permiten una caracterización funcional de linfocitos adherencia o quimiotaxis en definidas condiciones experimentales^16,17,18. En principio, ensayos de adherencia in vitro estática monitorea la capacidad de unión de los linfocitos cultivados para un monocapa endotelial o portaobjetos de vidrio recubiertas de moléculas de adhesión endotelial recombinantes (por ejemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), mientras el estándar in vitro ensayos de quimiotaxis se aplican generalmente para cuantificar la capacidad de los linfocitos que migran a lo largo de un gradiente de chemokine en un sistema de transwell¹⁹. Ambos parámetros in vitro permiten un ajuste controlado y la modulación de las condiciones experimentales, pero por otro lado carecen de variables importantes que críticamente impacto en vivo de quimiotaxis y adherencia de los linfocitos. Predominante, ensayos de cultura de célula estática ignoran la influencia de las fuerzas de corte causadas por el flujo de sangre permanente¹⁹ y potencialmente descuidan la participación del alrededor ambiente inmunológico e interactuando no linfocitos las células inmunes, presentes en un organismo vivo. Para superar estas limitaciones, la interpretación de los resultados adquiridos en ensayos de quimiotaxis o adherencia in vitro estática necesita validación en experimentos de adhesión dinámico bajo condiciones de flujo^20,21 y en modelos de órgano inflamatoria patología¹⁹en vivo. De hecho, importantes estudios en animales podrían extraer conclusiones sobre la regulación del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco en condiciones inflamatorias o alérgicas analizar genéticamente modificado ratones en modelos definidos de diferentes enfermedades pulmonares^{3, 22 , 23}. la comparación cuantitativa de pulmón infiltración linfocitos entre ratones de tipo salvaje y ratones con una deficiencia de un gen específico de interés representa una herramienta bien establecida y ampliamente usada para definir el impacto del celular particular vías o receptores en el patrón basados en la enfermedad de la distribución de la célula de T. Sin embargo, en contraste con antes de debate ensayos de cultivo celular in vitro, un diseño de estudio basado en modelos animales clásicos carece de la capacidad de análisis y control de las células T primarias humanas directamente derivadas de la sangre o de BAL de pacientes que sufren de una inflamación pulmonar de la enfermedad. Por lo tanto, sigue siendo difícil para validar funcionalmente si una enfermedad pulmonar diagnóstico especificado es capaz de imprimir los linfocitos humanos de tropismo preferencial de pulmón y hasta qué punto los parámetros clínicos puedan impactar en este escenario. Recientemente, un enfoque muy elegante en vivo fue introducido en el contexto de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que fue capaz de superar la mayoría de estas limitaciones y abre nuevos caminos para estudios traslacionales en intestinal linfocito autoguiado hacia el blanco²⁴ . Tomando ventaja de los protocolos para el claro del tejido base solvente seguida por microscopia de fluorescencia de luz de hoja transversal como una poderosa herramienta de imagen, fue posible visualizar la infiltración y distribución de las células de T humanas eventualmente transferidas en el intestino de ratones inmunodeficientes colitic²⁴. En particular, esta configuración experimental implementó dos innovaciones principales: las células inmunitarias humanas primarias (1) pueden ser analizado bajo condiciones en vivo experimentalmente definidas; (2) un área bastante grande del órgano enfermo (aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm) puede ser reflejada en la calidad de alta resolución, seguida de reconstrucción 3D. Por otra parte, varios estudios recientes establecieron con éxito el uso de tejido base solvente claro y microscopía de fluorescencia de la hoja de luz como herramientas importantes para^25,26la proyección de imagen avanzada del pulmón. Para poder beneficiarse de este avance tecnológico en el campo de la inmunología pulmonar, ahora adoptamos el sistema de análisis de homing de pulmón.

El protocolo presentado aquí ofrece una introducción paso a paso cómo purificar y fluorescencia etiqueta T humanos primario de las células de transferencia en ratones con inflamación pulmonar inducida y, por otra parte, describe en detalle el proceso posterior de la hoja de luz imágenes microscópicas de fluorescencia, como órgano preparación y procesamiento de imágenes. En general, esperamos apoyar futuros estudios traslacionales en el campo de las enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas mediante la introducción de un sofisticado, pero sin embargo factible modelo experimental para el monitoreo de linfocitos humanos pulmón autoguiado hacia el blanco en condiciones in vivo.

Protocol

Experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por las autoridades locales competentes en Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania). Ratones fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas. La colección de la sangre humana fue aprobada por el Comité de ética local y la Junta de revisión institucional de la Universidad de Erlangen-Nuremberg. Cada paciente dio consentimiento de informado escrita. 1. inducir inflamación alérgica del p…

Representative Results

El protocolo presentado describe un modelo experimental de ratón, que permite monitoreo y cuantificación de la acumulación de linfocitos T humanos eventualmente transferidos en el pulmón mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz. Figura 1 Proporciona un Resumen esquemático de los pasos en vivo del programa experimental . Para garantizar resultados confiables, se etiqueta de sustancial importancia para garantizar una buena calidad de los aislados y fluore…

Discussion

El nivel experimental descrito aquí proporciona la oportunidad de controlar la capacidad recalada de pulmón de células inmunes humanas primarias bajo condiciones inflamatorias in vivo y así relevante complementos clásico realiza quimiotaxis y adherencia in vitro ensayos. Para tener en las características de órgano anatómico específico de cuenta del pulmón, aspectos importantes de la célula inmune autoguiado hacia el blanco (incluyendo chemotaxis y célula de distribución dentro de…

Materials

Agarose NEEO Ultra	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody	BioLegend, San Diego, USA	304060
Ammonium chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	K2981
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	301300
Cell proliferation dye eflour670	eBioscience Inc., San Diego, USA	65-0840-85
CD4 MicroBeads, human	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	21066001
Ethly cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte	PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany	P40-47500
Filter 100 µm	VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany	732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2	Bitplane AG, Zurich, Switzerland	n.a.
ImspectorPro software	Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany	n.a.
Ketamin	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany	n.a.
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-303
Multifly cannula 20 G	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	851638035
30 G needle	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9161502
Neubauer counting chamber	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	C-1003
Pattex Glue	Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany	PSK1C
LS column	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)	anprotec	AC-AF-0018
RPMI medium	(Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany	61870-010
Papain	Merck	1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4	BioLegend, San Diego, USA	317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl	BioLegend, San Diego, USA	400337
PFA (paraformaldehyde)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	0335.1
Potassium hydrogen carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	P7481
Serological pipette 10 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	86.1254.001
Syringe 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9166017V
Syringe 5 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260067
Syringe 20 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260069
Tube 1.5 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,706,400
Tube 2 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72.695.400
Tube 2 ml, brown	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,695,001
Tube 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.554.502
Tube 50 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.547.254
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	KPOBD32