고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Summary

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

Abstract

매우 활성화 된 면역 세포의 조직 축적 압도적인 다양 한 만성 염증 성 질환의 특징을 대표 하 고 영향을 받는 환자의 임상 관리에 매력적인 치료 대상으로 등장. 프로-염증 성 면역 세포의 병 적 불균형 조직 침투의 치료 규제를 목표로 하는 전략을 더욱 최적화 하기 위해서는 그것은 향상 된 통찰력으로 질병 및 기관 관련을 달성 하기 위해 특별 한 중요성의 될 것입니다. 주변 세포의 속성을 추적 합니다. 여기 설명된 실험 프로토콜 papain 유도 폐 염증의 맥락에 놓여있는지 레이블 및 adoptively 전송 인간 림프 톨의 폐 축적을 모니터링할 수 있습니다. 면역 세포 이동과 chemotaxis 분석을 위해 자주 사용 표준 생체 외 분석 실험, 달리 지금 소개 vivo에서 설정 계정 폐 관련 조직 조직 및 복잡 한 염증의 영향으로 걸립니다. 시나리오 murine 생명체에서 일어나입니다. 또한, 3 차원 횡단면 빛 시트 형광 현미경 이미징만 양적 데이터, 면역 세포를 침투에 제공 하지 않습니다 하지만 또한 염증이 폐 내에서 면역 세포 지역화의 패턴을 보여 줍니다. 전반적으로, 우리는 제공 된 단계별 프로토콜에 따라 쉽게 적용 될 수 있는 만성 염증 성 폐 질환의 분야에서 면역학 연구에 대 한 높은 값의 혁신적인 기술을 소개 수 있습니다.

Introduction

알레르기 천식 등 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐의 고전적인 염증 성 질환으로 폐 조직^1,2활성화 된 림프 톨의 증가 채용에 의해 구동 잘 알려져 있습니다. 림프 구 출시 cytokines (예를 들어, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-9, IL-13, TNF-α와 IFN-γ) 더 타고 난 및 적응형 면역 세포의 chemotaxis를 홍보, 거리 기도 개장을 유도 하거나 직접 폐 실질²손상. 지금까지, 폐 조직 내에서 세포의 병 적인 축적에 대 한 책임 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지. 조직 선택적 T 세포 각 인 그리고 피부 본질적인 유도 대 한 설명에 비유, 폐 모 수석 세포 (DCs)는 분명히에 적어도 분할 CCR4 식의 유도 통해 우선 폐 침투에 대 한 주변 T 세포를 수는 림프 톨³의 표면입니다. CCR4, 외 기도 침투 T 세포는 CCR5와 CXCR3 주변 혈액^1,,45내의 T 세포에 비해 chemokine 수용 체의 증가 특히 식 또한 특징. 전반적으로, 기존 데이터 폐 유도 생리 또는 염증 성 조건에서 T 세포의 다른 chemokine 수용 체와 그들의 각각 ligands의 수를 포함 하 고 따라서 결정적으로 의존 개념와 일치 하는 밀접 하 게 타고 난 및 적응형 면역 세포¹간의 협업을 제어. 특히, 병원 체 또는 알레르기에 노출의 초기 단계, 타고 난 면역 계통의 세포 응답 TLR 자극 또는 LTB₄, CCL1, CCL17, 같은 다른 chemoattractants의 즉각적인 석방 cross-linking IgE 중재 PGD, CXCL10, CCL20, CCL22₂^1,,67. 대표적인 사례로 PGD₂ 와 chemoattractant 수용 체 간의 상호 작용 CRTh2 Th2 세포의 chemotaxis에 대 한 특정 중요성의 것으로 알려져 있다 하 고 따라서 나타났다 천식의 임상 관리에 유망 치료 대상. 실제로, 온건한 천식 환자 증상의 개선 및 치료 후 1 초 (FEV₁)에서 강제로 내쉬는 숨의 볼륨의 상당한 증가와 보여주었다 위약 그룹^{8 에 비해 선택적 CRTh2 길 항 9}. 염증 반응의 더 진행된 상태에서 이미 채용된 T 세포 폐 림프 구 축적 발표를 통해 IL-4, IL-13의 강력한 자극으로 폐 Dc에 대 한 증폭 수 있습니다. 그 후, 이러한 골수성 파생 된 타고 난 셀 최대-규제 STAT6 종속 방식으로^1,,1011CCL17 및 CCL22의 표현.  있지만 설명된 시나리오의 복잡성은 여전히 귀환 T 세포 폐의 완전 한 이해를 방해, 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 잠재적으로 최적화 된 치료 제어를 위한 분자 대상의 과다를 제공 합니다. 따라서, 기술의 혁신적인 실험, 더 깊게 T 셀 chemotaxis 및 폐 유도의 분야에서 우리의 지식을 보완 하는 긴급 한 필요가 있다.

사실은 폐 유도 인체 내에서 세포의 여러 세포, 체액 및 물리적 매개 변수¹에 의해 영향을 받습니다, 대부분 기존 실험 방법의 면역학 프로세스의 전체 복잡성을 모델링 할 수 없습니다. 대신, 림프 구 매력, 접착, 마이그레이션 및 보존 캐스케이드에 관련 된 특정 측면에 초점을 선택적으로 귀환 하는 폐의 분석에 대 한 많은 표준 프로토콜. 주변 또는 폐에 침투 림프 톨에 integrins 및 chemokine 수용 체의 mRNA 나 단백질 식 패턴의 혈액, 각각 chemokine 수준 보완 측정의 순전히 설명 결정 외 bronchoalveolar 게 (발) 또는 폐 조직^12,13,,1415, 잘 설립 체 외 세포 문화 분석 허용 림프 구 접착 또는 chemotaxis의 기능 특성 따라 실험 조건^16,,1718정의. 원칙적으로, 정적 생체 접착 분석 표준 생체 외에서 하는 동안 교양된 세포는 내 피 단층 또는 재조합 형 내 피 접착 분자 (MAdCAM-1, VCAM-1), 코팅 유리 슬라이드의 바인딩 용량 모니터링 chemotaxis 분석 실험 수 세포의 chemokine 그라데이션 transwell 시스템¹⁹에 따라 마이그레이션할 계량 하기 위해 일반적으로 적용 됩니다. 둘 다 생체 외에서 설정을 제어 조정 및 실험 조건, 변조 있지만 비판적 vivo에서 chemotaxis와 세포의 접착에 미치는 영향에 알려진 중요 한 변수를 다른 한편으로 부족. 정적 셀 문화 분석 실험¹⁹ 영구 혈액 흐름 의해 발생 하는 전단 세력의 영향을 무시 하 고 잠재적으로 면역 주변 환경 및 비 림프 구 면역 세포 상호 작용의 개입을 무시 하는 주로, 둘 다 살아있는 유기 체에. 이러한 한계를 극복 하기 위해 정적 생체 외에서 또는 준수 chemotaxis 분석 실험에서 얻은 결과의 해석 추가 동적 접착 실험 흐름 조건^20,21 에서 고에 유효성 검사에 필요한 염증 성 장기 병 리¹⁹의 vivo 모델. 실제로, 중요 한 동물 연구에서 T 세포 폐 염증 또는 알레르기 성 조건 하에서 귀환의 규제에 관한 결론을 얻을 수 수 유전자 분석 수정 다른 폐 질환^3, 의 정의 된 모델에서 마우스 ^{22 , 23}. 대 한 관심의 특정 유전자 나타냅니다 특정 세포의 영향을 정의 하기 위한 확고 하 고 광범위 하 게 사용 도구 wildtype 쥐와 쥐 결핍과 세포를 침투 하는 폐의 양적 비교 경로 또는 T 세포 분포의 질병 제어 패턴에 수용 체. 그러나, 달리 생체 외 세포 문화 분석, 논의 하기 전에 클래식 동물 모델에 따라 연구 설계 능력이 없다 분석 하 고 기본 인간 T 세포 혈액 또는 염증 성 폐에서 고통 받는 환자의 발에서 직접 파생 된 모니터링 질병입니다. 따라서, 그것은 여전히 기능 진단 지정 된 폐 질환은 우선 폐 차 있는 굴곡 운동 그리고 얼마나 멀리 임상 매개 변수 영향을 줄 수이 시나리오에 대 한 인간의 세포 간 기 수를 확인 하기 위해 도전 남아 있습니다. 최근, 매우 우아한 vivo에서 접근 대부분의 이러한 한계를 극복할 수 있었던 고 창 자 림프 톨 귀환^{24에 고급 변환 연구를 위한 새로운도 열 선 동적인 장 질병 (IBD)의 맥락에서 소개 되었다} . 용 매 기반 조직 비운 뒤에 강력한 이미징 도구로 횡단면 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 대 한 프로토콜을 이용 침투 및 adoptively 전송된 인간 T 세포의 분포를 시각화 가능 했다 colitic immunodeficient 마우스²⁴의 소장. 특히,이 실험 설정 두 가지 주요 혁신 구현: 실험적으로 정의 된 vivo에서 조건; (1) 기본 인간의 면역 세포를 분석할 수 있습니다 (2) 병에 걸리는 기관의 오히려 큰 영역 (약 1.5 c m x 1.5 c m) 고해상도 품질, 3D 개조 뒤에 몇 군데 있습니다. 또한, 여러 최근 연구 성공적으로 설립 용 매 기반 조직 삭제 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 고급 폐^25,26이미징에 대 한 중요 한 도구. 폐 면역학의 분야에서이 기술 진보에서 혜택, 우리는 지금 폐 유도의 분석을 위한 시스템을 채택 했다.

여기 제시 프로토콜 정화 방법과 붙일 레이블에 기본 인간 T 세포 유도 폐 염증와 쥐에 전송에 대 한, 또한, 빛 시트의 후속 과정 자세히 설명 단계별 소개를 제공 합니다. 기관 준비 및 이미지 처리를 포함 하 여 형광 현미경 이미지입니다. 전반적으로, 정교한 모니터링 vivo에서 조건에 따라 인간 림프 구 폐 유도 역시 가능한, 실험 모델만 도입 하 여 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 분야에서 미래의 변환 연구를 지원 하기 위해 노력 하겠습니다.

Protocol

실험 동물 관련 된 프로토콜 (Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 부츠 부르 크, 독일) 에를랑겐에서 관련 지방 자치 단체에 의해 승인에 따라 수행 했다. 마우스는 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다. 인간의 혈액의 수집 지역 윤리 위원회 에를랑겐 뉘른베르크의 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 각 환자 서 면된 동의 했다. 1. 쥐에서 알레르기 폐 염증 유?…

Representative Results

제시 프로토콜 모니터링 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 통해 폐에 adoptively 전송된 인간 T 림프 톨의 축적을 측정 하는 실험 마우스 모델을 설명 합니다. 그림 1 A 생체 조건 실험 일정 단계의 도식 개요를 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 그것은 좋은 품질은 절연 및 붙일 수 있도록 상당한 중요성의 표시 인간의 CD4+ T 세포, 이후에 ?…

Discussion

여기 설명된 실험 설정 제공 고전적인 vivo에서 염증 성 조건 및 그로 인하여 relevantly 보완 기본 인간의 면역 세포의 유도 폐 용량을 모니터링 하는 기회가 chemotaxis를 수행 하는 생체 접착 분석 실험입니다. 폐의 계정 특정 해부학 기관 특성 고려, 임상 관련성 및 수집 된 데이터의 양도 (를 포함 하 여 대상 기관 안에 chemotaxis 및 셀 유통) 귀환 하는 면역 세포의 중요 한 측면 우?…

Materials

Agarose NEEO Ultra	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody	BioLegend, San Diego, USA	304060
Ammonium chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	K2981
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	301300
Cell proliferation dye eflour670	eBioscience Inc., San Diego, USA	65-0840-85
CD4 MicroBeads, human	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	21066001
Ethly cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte	PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany	P40-47500
Filter 100 µm	VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany	732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2	Bitplane AG, Zurich, Switzerland	n.a.
ImspectorPro software	Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany	n.a.
Ketamin	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany	n.a.
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-303
Multifly cannula 20 G	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	851638035
30 G needle	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9161502
Neubauer counting chamber	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	C-1003
Pattex Glue	Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany	PSK1C
LS column	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)	anprotec	AC-AF-0018
RPMI medium	(Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany	61870-010
Papain	Merck	1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4	BioLegend, San Diego, USA	317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl	BioLegend, San Diego, USA	400337
PFA (paraformaldehyde)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	0335.1
Potassium hydrogen carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	P7481
Serological pipette 10 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	86.1254.001
Syringe 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9166017V
Syringe 5 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260067
Syringe 20 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260069
Tube 1.5 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,706,400
Tube 2 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72.695.400
Tube 2 ml, brown	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,695,001
Tube 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.554.502
Tube 50 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.547.254
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	KPOBD32