Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Summary

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Abstract

Esmagadora de acumulação de tecido de células do sistema imunológico altamente ativadas representa uma marca registrada de várias doenças inflamatórias crônicas e emergiu como um alvo terapêutico atraente no manejo clínico dos pacientes afetados. Para otimizar ainda mais as estratégias destinadas a terapêutico regulamento de infiltração de tecido patologicamente desequilibrada de células do sistema imunológico pró-inflamatórias, será de grande importância para atingir melhorou introspecções em doenças e órgão-específicas Localização de propriedades de linfócitos periféricos. O protocolo experimental descrito aqui permite monitorar o acúmulo de pulmão de linfócitos humanos fluorescente etiquetados e enviaram transferidos no contexto de inflamação pulmonar induzida por papaína. Em contraste com ensaios in vitro padrão frequentemente utilizados para a análise da migração de células imunes e quimiotaxia, a configuração em vivo agora introduzida leva em conta os aspectos de pulmão específicas de organização do tecido e a influência do complexo inflamatório cenário que ocorrem no organismo vivo murino. Além disso, imagem microscópica tridimensional transversal fluorescência de luz-folha só não fornece dados quantitativos sobre a infiltração de células do sistema imunológico, mas também descreve o padrão de localização da célula imune dentro do pulmão inflamado. Em geral, somos capazes de introduzir uma técnica inovadora de alto valor para a investigação imunológica no campo das doenças pulmonar inflamatória crônica, que pode ser facilmente aplicado, seguindo o protocolo passo a passo fornecido.

Introduction

Desordens inflamatórias clássicos do pulmão, como alérgica asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), são conhecidos para ser conduzido por um maior recrutamento de linfócitos ativados no tecido pulmonar^1,2. Linfócito-lançado citocinas (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promover quimiotaxia de células do sistema imunológico inatas e adaptativas, induzir a remodelação das vias respiratórias fibrótica ou danificar diretamente o de parênquima pulmonar². Até agora, os mecanismos subjacentes responsáveis para o acúmulo patológico de linfócitos no tecido pulmonar não são ainda totalmente compreendidos. Em analogia à impressão de tecido-seletiva de célula T descrito para hospedagens de intestino e pele, pulmonares células dendríticas (DCs) são obviamente capazes de prime periféricas células T para infiltração pulmonar preferencial, pelo menos em parte através da indução de expressão CCR4 na superfície de linfócitos³. Além de CCR4, as células T infiltrando as vias aéreas também são caracterizadas por uma expressão particularmente aumentada dos receptores de chemokine CCR5 e CXCR3 em comparação com as células T no sangue periférico^1,4,5. Globalmente, existentes de dados são consistentes com o conceito que homing de pulmão dos linfócitos T sob condições fisiológicas ou inflamatórios envolve uma série de chemokine diferentes receptores e seus respectivos ligantes e assim crucialmente depende uma estreita colaboração controlada a colaboração entre células do sistema imunológico inato e adaptativo¹. Especialmente, durante a fase inicial de exposição do patógeno ou alérgeno, células do sistema imunológico inato respondem à estimulação TLR ou do cross-linking IgE mediada pela liberação imediata de diferentes quimioatraentes, como LTB₄, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD₂^1,6,7. Como um exemplo, a interação entre o PGD₂ e o receptor quimiotático CRTh2 é conhecido por ser de particular importância para a quimiotaxia de células Th2 e assim apareceu o alvo terapêutico tão promissor no manejo clínico de asma. De fato, pacientes com asma moderada mostraram uma melhoria dos sintomas e um aumento significativo do volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF₁) após o tratamento com um antagonista seletivo de CRTh2 em comparação com o placebo grupo^{8 ,9}. Em um estado mais progrediu da resposta inflamatória, já recrutou as células T são capazes de amplificar ainda mais o acúmulo de linfócitos pulmonar através da liberação de IL-4 e IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, essas células inatas mieloide-derivado up-regulam a expressão de CCL17 e CCL22 em um STAT6-dependente maneira^1,10,11.  Embora a complexidade do cenário descrito ainda dificulta uma compreensão completa do pulmão de células T de orientação, oferece uma infinidade de alvos moleculares para um controle terapêutico potencialmente otimizado de doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas. Portanto, há uma necessidade urgente de técnicas experimentais inovadoras, capazes de complementar nosso conhecimento no campo da quimiotaxia de células T e hospedagens de pulmão e aprofundar ainda mais.

Devido ao fato de que a orientação do pulmão de linfócitos dentro do corpo humano é influenciada por vários parâmetros celular, humoral e física¹, a maioria dos métodos experimentais existentes não é capaz de modelar a toda complexidade deste processo imunológico. Em vez disso, muitos protocolos padrão para a análise do pulmão orientação seletivamente focar um aspecto específico envolvido em cascata de atração de linfócitos, adesão, migração e retenção. Além de uma determinação puramente descritiva do padrão de expressão do mRNA ou proteínas dos receptores integrinas e chemokine em linfócitos periféricos ou pulmão infiltrando e a medida complementar do chemokine respectivos níveis no sangue, lavagem broncoalveolar (BAL) ou tecido pulmonar^12,13,14,15, ensaios de cultura de células in vitro bem-estabelecida permitem uma caracterização funcional da aderência dos linfócitos ou quimiotaxia após definidas condições experimentais^16,17,18. Em princípio, os ensaios de aderência in vitro estático monitoram a capacidade de ligação de linfócitos culturas uma monocamada endotelial ou lâminas de vidro revestidas com moléculas de adesão endotelial recombinante (por exemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), enquanto norma in vitro ensaios de quimiotaxia geralmente são aplicados de forma a quantificar a capacidade dos linfócitos de migrar ao longo de um gradiente de chemokine em um sistema de transwell¹⁹. Ambas as configurações em vitro permitem um ajuste controlado e modulação das condições experimentais, mas por outro lado, falta variáveis importantes conhecidas por criticamente o impacto na quimiotaxia in vivo e aderência dos linfócitos. Predominantemente, ensaios de cultura estáticas de célula desconsiderar a influência das forças de cisalhamento causado pelo fluxo de sangue permanente¹⁹ e potencialmente negligenciam o envolvimento do meio circundante de imunológico e interação não-linfócitos células imunes, os dois presentes em um organismo vivo. Para superar essas limitações, a interpretação dos resultados adquiridos em ensaios in vitro de quimiotaxia ou aderência estáticos precisa mais validação em experimentos de adesão dinâmico sob condições de fluxo^20,21 e em modelos de vivo do órgão inflamatória patologia¹⁹. De facto, importante na regulação do pulmão de células T orientação sob condições inflamatórias ou alérgicas poderia-se conclusões de estudos com animais analisando geneticamente modificado ratos em modelos definidos de diferentes doenças pulmonares^{3, 22 , 23}. a comparação quantitativa do pulmão infiltrando linfócitos entre sua ratos e camundongos com deficiência para um gene específico de interesse representa uma ferramenta bem estabelecida e amplamente utilizada para definir o impacto de celular particular caminhos ou receptores no padrão de distribuição de células T orientada para a doença. No entanto, em contraste com antes de que discutidos ensaios de cultura de células in vitro, um estudo design baseado em modelos animais clássicos não possui a capacidade de analisar e monitorar primárias células T humanas, diretamente derivadas do sangue ou BAL de pacientes que sofrem de um pulmão inflamatório doença. Assim, ainda permanece desafiador para validar funcionalmente se uma doença de pulmão para o diagnóstico especificado é capaz de imprimir linfócitos humanos para tropismo preferencial do pulmão e quão longe de parâmetros clínicos podem impacto sobre esse cenário. Recentemente, uma abordagem muito elegante em vivo foi introduzida no contexto de doenças inflamatória intestinal (IBD), que foi capaz de superar a maioria destas limitações e abriu novos caminhos para estudos avançados de translação no linfocito intestinal homing²⁴ . Aproveitando-se dos protocolos para compensação de tecido à base de solvente, seguido por microscopia de fluorescência de luz-folha transversal como uma poderosa ferramenta de geração de imagens, foi possível visualizar a infiltração e a distribuição de pilhas de T humanas enviaram transferidas no intestino de camundongos imunodeficientes colitic²⁴. Em particular, essa configuração experimental implementado duas inovações principais: (1) células do sistema imunológico humano primário podem ser analisado sob condições in vivo experimentalmente definidas; (2) uma área bastante grande do órgão doente (aproximadamente 1,5 x 1,5 cm) pode ser fotografada em qualidade de alta resolução, seguida de reconstrução 3D. Além disso, vários estudos recentes estabeleceram com êxito o uso de tecido à base de solvente limpando e microscopia de fluorescência de luz-folha como ferramentas importantes para o pulmão avançado de imagem^25,26. Para beneficiar desta evolução tecnológica no campo da imunologia pulmonar, adotamos o sistema de análise de hospedagens de pulmão.

O protocolo apresentado aqui oferece uma introdução passo a passo como purificar e fluorescente etiqueta primária humana T células para transferência em ratos com inflamação pulmonar induzida e, além disso, descreve em detalhes o processo subsequente de luz-folha fluorescência microscópico imagem latente, incluindo preparação de órgão e processamento de imagem. Em geral, esperamos apoiar estudos translacionais futuros no campo das doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas introduzindo um sofisticado, mas o modelo experimental, no entanto, viável para o monitoramento de hospedagens de pulmão linfócito humano nas condições in vivo.

Protocol

Foram realizados experimentos envolvendo animais em conformidade com os protocolos aprovados pelas autoridades locais relevantes em Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha). Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. A coleção de sangue humano foi aprovada pelo Comitê de ético local e o Conselho de revisão institucional da Universidade de Erlangen-Nuremberga. Cada paciente deu consentimento escrito. 1. induzir inflamação alér…

Representative Results

O protocolo apresentado descreve um modelo experimental do mouse, que permite o monitoramento e quantificar o acúmulo de linfócitos humanos enviaram transferidos do T no pulmão através de microscopia de fluorescência de luz-folha. Figura 1 A fornece uma visão esquemática das etapas em vivo do programa experimental. Para garantir resultados confiáveis, é de substancial importância para garantir uma boa qualidade de isolados e fluorescente rotulado CD4 humano+<…

Discussion

A configuração experimental descrita aqui fornece a oportunidade de monitorar a capacidade de localização pulmonar de células humanas primárias do imunes sob condições inflamatórias em vivo e desse modo relevante complementa classicamente realizada quimiotaxia e adesão in vitro ensaios. Para tomar em características de órgão anatômico específico conta do pulmão, aspectos importantes da célula imune homing (incluindo distribuição de quimiotaxia e célula dentro do órgão-al…

Materials

Agarose NEEO Ultra	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody	BioLegend, San Diego, USA	304060
Ammonium chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	K2981
Cannula 21 G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	301300
Cell proliferation dye eflour670	eBioscience Inc., San Diego, USA	65-0840-85
CD4 MicroBeads, human	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	21066001
Ethly cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte	PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany	P40-47500
Filter 100 µm	VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany	732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2	Bitplane AG, Zurich, Switzerland	n.a.
ImspectorPro software	Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany	n.a.
Ketamin	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany	n.a.
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-303
Multifly cannula 20 G	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	851638035
30 G needle	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9161502
Neubauer counting chamber	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	C-1003
Pattex Glue	Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany	PSK1C
LS column	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml)	anprotec	AC-AF-0018
RPMI medium	(Gibco) Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany	61870-010
Papain	Merck	1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4	BioLegend, San Diego, USA	317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl	BioLegend, San Diego, USA	400337
PFA (paraformaldehyde)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	0335.1
Potassium hydrogen carbonate	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany	P7481
Serological pipette 10 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	86.1254.001
Syringe 1 ml	B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany	9166017V
Syringe 5 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260067
Syringe 20 ml	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA	260069
Tube 1.5 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,706,400
Tube 2 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72.695.400
Tube 2 ml, brown	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	72,695,001
Tube 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.554.502
Tube 50 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62.547.254
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany	130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	KPOBD32