Summary
המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק פרטים כיצד להקליט פוטנציאל ממברנה (Vm) מעורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה של המיקרואלקטרודה. העורק האמצעי של המוח הבינוני הוא בינוני כדי לצבור טון מיוגני, והקיר כלי מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה.
Abstract
פוטנציאל ממברנה (Vm) של תאים וסקולרית חלקה שרירים קובע את הטון כלי ולכן זרימת הדם לאיבר. שינויים בביטוי ובתפקוד של ערוצי יונים ומשאבות אלקטרוגניים המסדירים Vm בתנאי מחלה עלול לשנות vm, הטון כלי דם, זרימת הדם. לפיכך, הבנה בסיסית של האלקטרופיזיולוגיה והשיטות הדרושות לתיעוד מדויק של Vm במדינות בריאות וחולות חיוניות. שיטה זו תאפשר Vm מאפטינג באמצעות סוכני תרופתי שונים כדי לשחזר vm. למרות שישנן מספר שיטות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות, מאמר זה מספק פרוטוקולים להקליט Vm מכלי התנגדות can, כמו עורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה מיקרואלקטרודה. העורקים האמצעיים מורשים לצבור טון מיוגני בחדר מיוגרף, וקיר כלי הקיבול מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה. האות Vm נאסף דרך מד חשמלית, סרוקים, ומנותח. שיטה זו מספקת קריאה מדויקת של Vm של קיר כלי מבלי לפגוע בתאים ומבלי לשנות את התנגדות הקרום.
Introduction
פוטנציאל הממברנה (Vm) של תא מתייחס להפרש היחסי של המטען היוני על פני קרום הפלזמה והחדירות היחסיות של הקרום ליונים אלה. ה-Vm מופק על ידי התפלגות דיפרנציאלית של יונים והוא מתוחזק על ידי ערוצי יונים ומשאבות. ערוצי יונים כגון K+, Na+, ו- Cl לתרום באופן משמעותיעל V מנוחה. תאי שריר וסקולריים חלקים (VSMCs) מבטאים יותר מארבעה סוגים שונים של K+ ערוצים1, שני סוגים של Ca מגודרת מתח2 + ערוצים (וומשפ)2, יותר משני סוגים של הערוצים Cl3, ד , 5, Ca מופעל החנות2 + ערוצים6, מתיחה מופעל ערוצי הקטיון7,8, ו אלקטרוגניים נתרן אשלגן משאבות atpase9 בקרום הפלזמה שלהם, כולם עשויים להיות מעורב בוויסות של Vm.
המבקרים של VSMCs תלויים בלחץ של לומן. בכלי שאינו מווסת, Vm משתנה מ-50 ל-65 mV, עם זאת, במקטעים עורקים בלחץ, Vm טווחים מ-37 כדי-47 mV10. העלאת הלחץ הintravascular גורמת ל-VSMCs להקטטת11, מקטינה את הסף לפתיחת ומדינת ומגבירה את הזרמת הסידן לפיתוח הטון היוגני12. להיפך, בכלי של פסיבי או לא בלחץ, היפרפולריזציה ממברנה, בשל פעילות גבוהה K+ ערוץ, תמנע vgcc ש מפתיחה, וכתוצאה מכך כניסת סידן מוגבלת ירידה סידן תאיים, תורם פחות וסקולרית מגוון13 כך, Vm בשל שינויים בלחץ לומן מופיע לשחק תפקיד חיוני בפיתוח הטון כלי דם, הן vgcc ו-K+ ערוצים לשחק תפקיד מכריע בוויסות של Vm.
Vm משתנה בין סוג כלי ומינים. Vm הוא-54 ± 1.3 mV ב החזיר גינאה מעולה רצועות עורק מצע14,-45 ± 1 mV בתוך העורקים התיכונה במוח באמצע בשנת 60 mmhg לומן12, ו-35 ± 1 mV ב החולדה בתוך העורק העכברוש בשנת 40 משעה לומן לחץ15. Vm מנוחה הקליט שריר לימפטי עכברוש לא מתוח הוא-48 ± 2 mV16. Vm של המוח VSMCs שלילי יותר מאשר בעורקים היקפיים. לעומת זאת, העורקים האמצעיים הביניים של חתולים דווחו להיות Vm של כ-70 mV, בעוד מסנטרמית ועורקים כליליים דווחו יש-49 ו-58 mV, בהתאמה17,18. הבדלים ב Vm על פני מיטות כלי הדם עשויים לשקף את ההבדלים בביטוי ותפקוד של ערוצי יונים ומשאבות אלקטרוגניים נתרן אשלגן.
עליות וירידות ב Vm מכונים דפולריזציה קרום ו hyperpolarization, בהתאמה. שינויים אלה ב-Vm לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים רבים, כולל ערוץ יון הערוצים, איתות התא, התכווצות שרירים, פעולה פוטנציאלית התפשטות. בלחץ קבוע, הרבה אנדוגני וחומרים סינתטיים vasodilator המפעילים K+ ערוצים לגרום היפרפולריזציה ממברנה, וכתוצאה מכך vasodשיער1,13. לעומת זאת, הממברנה הקרום המתמשכת היא חיונית ב אגוניסט-המושרה או קולטן בתיווך מתווך19. Vm הוא משתנה קריטי שלא רק מווסת את ca2 + זרם דרך vgcc13 אלא גם משפיע על שחרורו של ca2 + מחנויות פנימיות20,21 ו-ca2-רגישות של את מנגנון הקונאקטולה22
אמנם ישנן מספר שיטות כדי להקליט Vm מסוגי תאים שונים, נתונים שנאספו מהשיטה החלוקה של המיקרו אלקטרודה של כלי הקנוליום נראה פיזיולוגי יותר מאשר נתונים שהתקבלו VSMCs מבודדים. כאשר הוקלט מ VSMC מבודדים באמצעות שיטות התפס הנוכחי, Vm הוא נראה כמו היפרפולציות חולף ספונטנית ב Vsmc24. VSMCs מבודדים אינם בסינציציום, והשינויים בהתנגדות הסדרה עשויים לתרום להתנהגות הנדנוד של Vm. מצד שני, התנהגות מנדנוד לא נצפתה כאשר Vm נרשם מכלי שלמים, כנראה בגלל מגע תא תא בין VSMCs כי הם בתוך syncytium בעורק ומואבקים ברחבי הכלי המוביל V m יציבה 24. לפיכך, המדידה של Vm מכלי הלחץ באמצעות טכניקת החלוקה המיקרואלקטרודה הסטנדרטית קרובה יחסית לתנאים הפיזיולוגיים.
הקלטת Vm מכלי הקיבול יכול לספק מידע חיוני, מאז Vm של vsmcs כי הם בסינציציום הוא אחד הדטרמיניזם העיקרי של הטון וזרימת הדם, והאפנון של Vm יכול לספק דרך להתרחב או כלי דם נוקשים. לכן, חיוני להבין את המתודולוגיה הכרוכה בהקלטת Vm. מאמר זה מתאר הקלטה תאיים של Vm מתוך העורקים האמצעיים הבינוני canנולה (mcas) באמצעות שיטת מימון מיקרואלקטרודה. פרוטוקול זה יתאר כיצד להכין MCAs, microelectrodes, להגדיר את מד האלקטו לבצע את שיטת החלוקה כדי להקליט Vm. כמו כן, נתונים מייצגים, בעיות נפוצות שאירעו בעת שימוש בשיטה זו ונדונו בעיות פוטנציאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
העכברושים הזכרים שוכנו במתקן לטיפול בבעלי חיים ב UMMC, אשר אושרה על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC). לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים במהלך המחקר. בעלי חיים שמרו בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה של 24 ± 2 ° צ', רמות לחות של 60-80% ו 12 h מחזורי אור/כהה. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש UMMC.
1. הכנת ציוד
- מניחים מגבר כפול בערוץ התקשורת הדיפרנציאלי (ראה טבלת החומרים) קרוב לחדר הקיבול ובמיקום הרצוי.
- חבר את הפלט של ערוץ המגבר A או B לכניסת הערוץ של התקן הדיגיטציה עם כבל BNC-BNC.
- הרכב המקדח במיקרומניפולציה ומניחים אותו ליד המיקרוסקופ והיוגרף. יש להתקין את כיוונון ההקלטה על שולחן ללא רטט.
- הצב את הידיות והמתגים בחזית המגבר במיקומים הקובעים את התצורה שלו לניסוי זה כמתואר במדריך.
- לחבר את הקרקע אמבטיה לשטח המעגל של המגבר דרך עם האלקטרודה המתאימה. באופן דומה, ודא שהכלוב מקורקע למארז המגבר.
2. הכנת מיקרואלקטרודות והרכבה
-
השתמש מיקרואלקטרודות זכוכית בורוסיליקט (לראות את הטבלה של חומרים) ולמשוך את העצה זכוכית יש 8 – 10 מ"מ להתחדד, קוטר של < 1 יקרומטר ו התנגדות של 80 – 120 MΩ כאשר מתמלא 3 M kcl.
- השתמש בפולר רגיל כדי להשיג להתחדד הדרגתית קצר באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 650; מהירות = 20; למשוך = 25; time = 250 ולולאה פעמיים לעמידות גבוהה יותר ועצות קטנות יותר. עיין בטבלת החומרים כאשר ההגדרות הן ספציפיות לכלי.
הערה: העצה קטרים < 1 יקרומטר יגרום נזק מינימלי לתא כאשר שופד.
- השתמש בפולר רגיל כדי להשיג להתחדד הדרגתית קצר באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 650; מהירות = 20; למשוך = 25; time = 250 ולולאה פעמיים לעמידות גבוהה יותר ועצות קטנות יותר. עיין בטבלת החומרים כאשר ההגדרות הן ספציפיות לכלי.
-
ממלאים את המיקרואלקטרודה עם 3 מטרים מתוך מזרק מיקרופייבר (ראו את שולחן החומרים).
- משוך באיטיות את הבוכנה של מזרק מיקרופייבר תוך הזרקת 3 מ ' KCl לתוך המיקרואלקטרודה כדי לאפשר מקום לנוזל למלא ולמנוע היווצרות בועות אוויר בתוך המיקרואלקטרודה.
- למלא את המיקרואלקטרודה עד מלא ולהבטיח כי אין בועות אוויר לפני הצבת אותו במחזיק מיקרואלקטרודה. אם הבועות הם נוכחים, הקש בעדינות על מיקרואלקטרודה עם אצבע כדי להסיר את הבועות.
- פעילות גופנית, לדחוף בחוזקה את האלקטרודה לתוך המחזיק דרך חור משועמם. אם נוזל עודף קיים, להסיר אותו עם רקמה.
- חבר את מכלול מחזיק האלקטרודות לגשוש המגבר. ביצוע בדיקת אלקטרודה, כוונן את היסט הקלט, ודא אפס הגדרה ובדוק את דליפת קלט הבדיקה לפי המדריך למגבר.
- מדידת עמידות האלקטרודה באמצעות בדיקת אלקטרודה כפי שמוצג בטבלה 1.
- שים לב שאלקטרודה עובדת מציגה משמרת חיובית של מתח DC של 1 mV/MΩ בפלט הערוץ. מצד שני, אם מתח גדול מופיע על הפלט הערוץ ועל מד, זה מצביע על אלקטרודה חסומה או שבורה.
- פתח את תוכנת ההקלטה, הקצה שם לקובץ ושמור אותו לניתוח עתידי בתוכנת אחסון.
3. בידוד והצינורית של עורק המוח האמצעי
-
הכנת הריאגנטים.
- הכינו פתרון רגיל ונמוך של סידן פיזיולוגי (PSS) כמתואר בטבלה 2.
-
הכן את היוגרף.
- לשטוף את החדר מיוגרף (לראות את הטבלה של חומרים) עם מים מזוקקים פעמים מרובות כדי לשמור את זה ללא פסולת. טען את התא עם 5 מ ל של PSS נורמלי.
- ממלאים את שתי הצינורית זכוכית עם PSS רגיל מסוננים באמצעות מזרק 5-10 מ"ל. מלאו בזהירות את הצינורית כולה ואת הצינורות המצורפים בלי להציג בועות אוויר.
- הכינו שני תפרים מונופינט (10-0, 0.02 מ"מ) עם חצי קשר כל אחד באמצעות מלקחיים קהה.
- מניחים את התפר הסגור חלקית על שתי הצינורית מעט מהקצה באמצעות מלקחיים לחיתוך תחת מיקרוסקופ לנתיחה. מאוחר יותר הקשרים האלה החליקה וקשרו בזהירות על קצות העורקים הקנולסיים כדי לאבטח את כלי הקיבול.
-
. בידוד וצינורית בעורק האמצעי
- לגרום להרדמה מעמיקה בחולדה מג דאולי באמצעות 2 – 4% בשאיפה.
- ערוף את ראשו של העכברוש. באמצעות גיליוטינה בהרדמה עמוקה
- הסר בזהירות את הגולגולת באמצעות חותך העצם ומספריים.
- להסיר את המוח מהגולגולת ולמקם אותו ב 5 מ ל של סידן נמוך PSS על קרח.
- לזהות ולבתר קטע בלתי מסועף של עורק המוח האמצעי של עכברוש (MCA) עם קוטר פנימי של 100-200 יקרומטר מהמוח באמצעות מספריים באביב מלקחיים.
- הר MCA על הצינורית זכוכית באמצעות מלקחיים עדינים ומאובטח על ידי הידוק התפרים בתוך מיוגרף המכיל PSS נורמלי.
- , תסגור את הצינורית הזאת. כך שלא תהיה זרימה בתוך המקאס
- חבר את הצנרת הנכנס למאגר המחזיק PSS כדי לאפשר שליטה של לחץ intraluminal אשר יהיה מפוקח עם מתמר לחץ בתוך השורה.
- המחש את MCAs מקאס באמצעות מצלמת התקן בתשלום (ראה את טבלת החומרים) רכוב על מיקרוסקופ הפוך ותוכנת דימות.
- הגדר את אורך הציר של MCA לאורך משוער שבו הוא אמור להופיע לא נוקשה ולא רפוי.
- באמצעות שיווי משקל הפתרון עם O2 (95%) ו-CO2 (5%) ב 37 ° c כדי לספק חמצן מספקת, טמפרטורה כדי לשמור על pH ב 7.4.
-
לדקור (לחדור את קרום פלזמה התא) התאים שריר חלק כלי הדם.
- לחבר את האלקטרודות הקרקע ולשמור אותו שקוע PSS של מיוגרף.
- יאיר את תא כלי הקיבול והסתכל דרך המיקרוסקופ כדי להמחיש את קצה המיקרואלקטרודה בתמיסה של האמבט.
הערה: לחילופין, ניתן לדמיין את ה-MCA והמיקרואלקטרודה במחשב בעל תוכנת דימות. - השתמש בבקרי המיקרומניפולציה כדי להזיז את קצה המיקרואלקטרודה קרוב לקיר החיצוני של כלי הדם. המיקרומניפולציה וקצה המיקרואלקטרודה חייבים להיות במצב יציב ביחס לרקמה.
הערה: , לפני תחילת הניסויים. אשרו שמתח הקרום התייצב אם המתח הנמדד אינו יציב, החיבור בין האלקטרודה לבין התא אינו אטום, ומצביע על דליפה. - . התחילו בהקלטה
- הזיזו לאט את קצה המיקרואלקטרודה לעבר כלי הקיבול, המכוונים למרכז הכלי באמצעות כמובן או שליטה עדינה על המיקרומניפולציה.
הערה: מדי פעם, הסטה קטנה בהקלטה עשויה להיות נצפתה כאשר הטיפ מיקרואלקטרודה קשר קרום סיבי השריר. - כאשר העצה מגיעה בסמיכות לכלי הקיבול, העבר את האלקטרודה קדימה בתנועה מהירה אחת באמצעות המיקרומניפולציה כדי לבודד את קרום השריר.
- בשלב זה, ניתן להתחיל להתבונן בשינויים ב-Vm המוקלטת. אין לגעת במיקרומניפולציה כאשר המיקרואלקטרודה מחלק את קרום התא.
הערה: ההבדל בין מתח בין ההקלטה והיעץ האלקטרודה פוחתת מ -0 mV ל בין-40 mV ו-75 mV בהתאם לרמת הלחץ הintravascular או גירויים אחרים או גירוי מעכבות. קריאות אלה מאפיינות את ההפרש הפוטנציאלי האפשרי של התא הנוכחי. - ביצוע מספר רב של מבצעים על כלי אחד באזורים שונים של הכלי מבלי לפגוע VSMCs כדי לקבל מדידות מדויקות.
- לאחר ההקלטה, השתמש מניפולטור כדי להסיר את המיקרואלקטרודה בתנועה אחת מהירה.
- עצור את ההקלטה ושמור קבצי נתונים לצורך ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להשתמש בשיטה המוצגת באופן אמין להקלטת Vm בכלי קננולזה. הליך קצר המתאר כיצד לבודד את MCA מהמוח מוצג באיור 1A. לאחר הפרדת המוח מהגולגולת, הMCA הייתה מגולגלת ומונחת בצלחת פטרי המכילה את הסידן הנמוך PSS. חלק מרקמת החיבור כי היה מצורף גם היה גזור יחד עם MCA באמצעות מספריים באביב מלקחיים כדי למנוע נזק MCA במהלך הבידוד. בזהירות, רקמת חיבור הוסר גם, ואת גזור MCA היה מוכן להעביר ליוגרף. MCA הותקן על הצינורית ונקשר באמצעות תפרים בשני קצוות הצינורית ביויוגרף. ייצוג סכמטי של כיוונון שיטות טיפוסי של מיקרואלקטרודה מוצג באיור 1B. מיקרואלקטרודה שמלאה בשלושה מטרים הייתה מחוברת למטר האלקטלי באמצעות מחזיק בגשוש. פלט הערוץ של מד הלחץ היה מחובר לערוץ קלט אנלוגי של התקן דיגיטציה באמצעות כבל BNC-BNC. פלט התקן דיגיטציה התחבר עוד יותר לטווח הרחוק כדי להמחיש את האות בתוכנת ההקלטה. הקרקע מוקמת באמצעות חוט כרוב שמורחב ממארז האלקטלומטר לתמיסת האמבט במיוגרף. לבסוף, שרידים דיגיטליים דמיינו את תוכנת ההקלטה בצג המחשב.
MCA היתה לאחר מכן מודתה ב-PSS חם מוכן והוא היה מווסת ל 60 mmHg. רק כלי קיבול שניתן לצבור שימוש עבור הקלטה של Vm . לאחר שהספינה השיגה צליל משמעותי, המיקרואלקטרודה הייתה מתקדמת לתוך קיר כלי הקיבול. בקוטר העורקים ובחלוקה העורק היו דמיינו שימוש במיקרוסקופ וידאו. השחתה נחשבת מוצלחת כאשר יש הסטה מהירה לערכים שליליים, Vm יציב עבור ≥ 30, והמתח חוזר בפתאומיות ל -0 mV עם הסרת האלקטרודה כפי שמוצג באיור 212,15. התוצאות שלנו מרמזות כי, ב MCA כי הוא בלחץ כדי 60 mmHg, Vm הוא ~-43.2 ± 2.9 mV.
לאחר ייצוב מוצלח של V m, התרופות המשנים את ה-vמ' החלו באמבט ונרשמו שינויים ב-vm . השתמשנו 20 מ"מ KCl כדי לדפולזה ו 20 μM NS1619, מוליכות סינתטי גדול ה הערוץ אשלגן, כדי להקטפולזה קרום. התוצאות שלנו מרמזות כי זלוף של החדר עם kcl מקוטב את הקרום על ידי ~ 5.8 ± 0.18 mV. מצד שני, זלוף עם NS1619 hyperpolarized את הקרום על ידי ~ 3.8 ± 0.4 mV.
איור 1: איור של בידוד של עורקים המוח האמצעי והקלטה של פוטנציאל ממברנה באמצעות שיטת מימון מיקרואלקטרודה. (א) באמצעות מספריים באביב, חותכים את המוח או את רקמת החיבור לאורך הקווים המנוקדים. העבר ולטעון את MCA בין שתי הצינורית זכוכית ולאבטח אותו באמצעות תפרים בחדר מיוגרף מלא PSS. (ב) מיקרואלקטרודה מלאה 3 M kcl מוכנס למחזיק והוא מחובר הגשוש. שינויים בתנועה הפוטנציאלית הטרנסרפידת מהמקדח למטר ולדיגיטציה באמצעות כבל BNC (כבל BNC מחובר מתפוקת הערוצים של מד האלקטו לקלט אנלוגי של התקן דיגיטציה). הפוטנציאל הדיגיטלי נראה בתוכנת ההקלטה על הצג. הקרקע מוקמת באמצעות חוט כרוב מחובר ממטרים לתמיסה באמבט ביוגרף. MCA = עורק המוח האמצעי; PSS = תמיסת מלח פיזיולוגית; AgCl = כסף כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הקלטה של פוטנציאל ממברנה באמצעות שיטת מימון מיקרואלקטרודה מעורקי מוח בינוניים. מעקב מייצג של Vm. השחתה נחשבת מוצלחת אם יש הסטה פתאומית לערכים שליליים על כניסת אלקטרודה, Vm יציב עבור ≥ 30 s, ואת המתח חוזר בפתאומיות כדי 0 mV עם הסרת האלקטרודה. ציר ה-X מייצג את השעה, וציר Y מייצג את הפוטנציאל של הממברנה. הקו המנוקד מייצג את קו הבסיס המותאם לפני החלוקה המנוקדת של כלי הקיבול. שניה = שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקלטת שינויים בפוטנציאל הממברנה באמצעות שיטת מימון מיקרואלקטרודה כאשר כלי הקיבול חשופים לסוכני vasoactive. Vm הוקלט באמצעות שיטת מימון מיקרו של העורקים האמצעיים הבינוני לפני ואחרי חשיפה סוכנים vasoactive. מעקב לדוגמהמייצג (א) depolarization בתגובה 20 מ"מ kcl ו-(ב) היפרפולריזציה בתגובה 20 μm NS1619 – מוליכות גדולה של ערוץ אשלגן אגוניסט. (ג) גרף פס הסיכום של השינויים ב-Vm לפני ואחרי היישום של KCL ו-NS1619. הקו המנוקד מייצג מנוחה של Vm. המספר בסוגריים מייצג את מספר כלי הקיבול המשמשים במחקר. שים לב ש-Vm הגיעה לתוכנית הבסיסית ברגע שהסם נשטף. סרגל השגיאות מייצג את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. שניה = שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| הגדרות מדידת לחץ כדי למדוד עמידות אלקטרודה | |
| כניסת מטרים | ערוץ A או B |
| מיקום דו-מצבי | ב |
| מטווח מטר | לעבור אל 200 mV |
| אלקטרודה | באמבטיה |
| מצב | לפעול לבדיקת אלקטרודה |
| אינדיקציה מטר | 1 mV/MΩ |
טבלה 1: הגדרות של מד אלקטו למדוד התנגדות אלקטרודה.
| כימיקלים | הסידן הנמוכה PSS mM | רגיל PSS mM | חברה | קטלוג | |
| 1 | מיכל שלמה | 119.00 | 119.00 | סיגמא | S7653 |
| 2 | אשלגן כלורי | 4.70 | 4.70 | סיגמא | P4504 |
| 3 | מיכל בע | 1.17 | 1.17 | סיגמא | M7506 |
| 4 | מיכל2 | 0.05 | 1.60 | סיגמא | C3881 |
| מיכל 5 | מיכל ביטון | 5.00 | 5.00 | סיגמא | H7006 |
| 6 | גלוקוז | 10.00 | 10.00 | סיגמא | G7021 |
| 7 | חנה2 | 1.18 | 1.18 | סיגמא | S0751 |
| 8 | נחקו3 | 18.00 | 18.00 | סיגמא | S5761 |
| רמת pH: 7.4 | רמת pH: 7.4 |
שולחן 2: ריאגנטים בשימוש הכנת סידן נמוך ותמיסת מלח פיסיולוגית נורמלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מספק את השלבים הדרושים על אופן השימוש בשיטת החלוקה מיקרואלקטרודה חדה כדי להקליט את Vm מהכנה של כלי קיבול. שיטה זו משמשת רבות, ומציעה הקלטות באיכות גבוהה ועקביות של Vm העונים על מגוון רחב של שאלות נסיוניות.
מספר שיקולים קריטיים ושלבי פתרון בעיות מתוארים כאן כדי להבטיח את הצלחת השיטה. האיכות של המיקרואלקטרודה (החדות וההתנגדות שלה) והתהליך התאי הוא חודר להשפיע על היציבות והדיוק של Vm. אם האות מגיע ברציפות או מתחת לטווח ההקלטה של המגבר, סביר להניח שהאלקטרודה חסומה, או שהקצה שבור. אם החלוקה היחידה היא חלקית, לא מספיקה או פוגעת בתא, הפוטנציאל המוקלט מטפס חזרה ל-0 mV והתוצאה היא אות לא יציב או שאין אות. במקרים מסוימים, התוכן של התא יכול גם לחסום את האלקטרודה גבוהה מאוד התנגדות. כל הבעיות הללו ניתן להתגבר רק על ידי החלפת האלקטרודה עם אחד חדש.
לחלוקה מוצלחת, יש להבטיח כי ההתנגדות הכוללת של קרום התא אינה מלאה, והפוטנציאל הממברנה נמדד יציב ללא דליפות בין האלקטרודה לבין הקרום. זה קריטי כי האלקטרודה מתקדמת לכיוון התא על ידי מיקרומניפולציה יציבה. כאשר מתקדמים בתוך כמה מיקרומטר של התא, הפוטנציאל התשר ישתנה וכתוצאה מכך הטיה קלה במתח שזוהה. כדי למנוע פגיעה בקצה של האלקטרודה או מתיחה של קרום התא, ההתקדמות המהירה של האלקטרודה נדרשת. השחתה מוצלחת מתאפיינת ירידה מהירה בפוטנציאל הממברנה ואחריו ייצוב סביב הפוטנציאל הנוח של הקרום. אם הקריאה הפוטנציאלית לא משתנה, ייתכן קצה האלקטרודה יש שיבש את הקרום גורם נתרן לדלוף לתא ואשלגן לדלוף מתוך התא, וכתוצאה מכך depolarization מתקדמת. בעיה נוספת בשיטה זו היא שפוטנציאל ההסתעפויות והפוטנציאלים של קצה האלקטרודה יכולים להוסיף חפץ מיותר להקלטה Vm . פוטנציאל הצומת מתרחש כאשר מנצחים שונים באים במגע. ישנם שני סוגים שונים של פוטנציאל הצומת, נוזלי מתכת, נוזל נוזלי. צמתי מתכת נוזלית נוצרות כאשר קצה הגשוש מקשר את האלקטרוליט במיקרופיפטה. צמתים נוזל נוזלי, המכונה גם פוטנציאל הצומת נוזל, מתרחשים כאשר שני פתרונות של ריכוזים שונים באים במגע. הפצת היונים בין הפתרונות תורמת להתפתחות הפוטנציאל. חוץ מזה, המאפיינים של עצה האלקטרודות זכוכית אינטראקציה עם נוזל יכול ליצור פוטנציאל טיפים. כדי למזער את הצומת, כמו גם הפוטנציאל טיפים, תמקדים הפוטנציאל נמדד באמבטיה יכול להפחית את ההטיה לא רצויה. במהלך החלוקה, אי אפשר לשלול את האפשרות כי במקום שריר החלקה, Vm ניתן לטעום בשוגג בניסויים מסוימים. עם זאת, מחקרים מצביעים על כך ששכבות האנדותל ושכבות ה-VSMC מצמידים בחשמל בתוך הסדר הקטן ומציגים תגובות של Vm דומים23.
בסופו של דבר, שלושה צעדים בתהליך זה הם קריטיים להשגת הקלטות מוצלחות. ראשית, על כלי הדם להיות מוכנים כראוי, ולהבטיח כי הם אינם פגומים בתהליך. שנית, יש למשוך מיקרואלקטרודות. לתכונות החשמליות הנכונות לבסוף, החלוקה המהירה של קרום מבלי לשבור את הקצה הוא חיוני לתוצאות מדויקות. החוקר חייב להבין אלקטרופיזיולוגיה, כיצד ליצור מיקרואלקטרודות קיימא, וכיצד להתקין ולהשתמש במטר אלקטו.
למרות חשיבותו, לשיטה זו יש מגבלות שונות. ראשית, עלות הצבירה כדי להשיג את כל הציוד הוא גבוה (~ $30-40000). שנית, כלים טריים נחוצים עבור כל הניסויים האלה; מכאן שחיה מורמתת לכל ניסוי, ומוסיפה לעלות הכוללת. שלישית, ניתוח עורקי מוחין, הצינורית של כלי הדם היא מייגעת, יקרה ויש לו עקומת למידה. הרביעית, הכנת המיקרואלקטרודות, החלוקה לבית וההקלטה Vm מחייבת הבנה יסודית של הפיזיולוגיה. לבסוף, כדי להקים את הקבוצה הזאת במעבדה דורש צוות מסור, זמן ומאמץ.
Vm הוא נכס אלקטרולוגי חיוני הקובע את הטון כלי הדם ולכן זרימת הדם לאיבר. Vm יכול להיות שונה על ידי כמה כימיקלים vasoactive שפורסמו מפני נוירונים, אנדותל ורכיבי דם. בעוד ואסיאוטורים מרססים את. הקרום, מרחיבים את הקרום כמה חלבונים כולל K+ ערוצים, vgcc ', נתרן אשלגן Atpase, Ca2 + Atpase, Cl- ערוצים, מפעל מופעל וערוצים למתוח לווסת את Vm. שינויים בכל החלבונים האלה בתנאי מחלה עלול לשנות Vm ולכן הטון כלי דם זרימת הדם. שיטת החלוקה המיקרואלקטרודה שימושית להקלטה מונחת ושינויים ב-Vm בתגובה לכלי הקשר והדיקטורים. כך, שיטה זו יכולה לשמש אמין כדי להבין נורמלי ושונה Vm הקשורים למחלה, והוא עשוי להיות שימושי בפיתוח של סוכני תרופתי המיועדים לווסת Vm, כלי הדם וזרימת הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת בחלק על ידי מענקים מתוכנית מחקר תמיכה של הפנים (IRSP) מ UMMC, AHA מדען פיתוח מענק (13SDG14000006) הוענק Mallikarjuna R. פאבאלי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , Taylor & Francis. (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T.
