Summary
이 문서의 주요 목표는 미세 전극 impalement방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥에서 막 전위 (Vm)를 기록하는 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것입니다. 굴절된 중간 대뇌 동맥은 근진한 톤을 얻기 위해 평형화되고, 혈관 벽은 높은 저항 성 미세 전극을 사용하여 찔려있습니다.
Abstract
혈관 평활근 세포의 막 전위 (V m)는 혈관 톤을 결정하고 따라서 장기에 혈류를 결정합니다. 질병 조건에서 V m을 조절하는 이온 채널 및 전기 생성 펌프의 발현 및 기능의 변화는 잠재적으로 Vm,혈관 톤 및 혈류를 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 전기생리학에 대한 기본적인 이해와 건강하고 병들린 상태에서 Vm을 정확하게 기록하는 데 필요한 방법이 필수적이다. 이 방법을 사용하면 다른 약리학 적 에이전트를 사용하여 V m을 변조하여 V m을 복원 할 수있습니다. 여러 가지 방법이 있지만, 각각의 장점과 단점을 가지고 있지만, 이 문서는 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥과 같은 혼수 저항 혈관으로부터 Vm을 기록하는 프로토콜을 제공한다. 중간 대뇌 동맥은 myograph 챔버에서 myogenic 톤을 얻기 위하여 허용되고, 혈관 벽은 높은 저항 마이크로 전극을 사용하여 찔려 있습니다. Vm 신호는 전계를 통해 수집되고 디지털화되고 분석됩니다. 이 방법은 세포를 손상시키지 않고 멤브레인 저항을 변경하지 않고 용기 벽의 Vm을 정확하게 판독할 수 있습니다.
Introduction
세포의 멤브레인전위(Vm)는 혈장 막을 가로지르는 이온 전하의 상대적 차이와 이러한 이온에 대한 멤브레인의 상대적 투과성을 지칭한다. Vm은 이온의 차동 분포에 의해 생성되며 이온 채널 과 펌프에 의해 유지됩니다. K+, Na+및 Cl과 같은 이온 채널은 휴식 VM에실질적으로 기여합니다. 혈관 평활근 세포 (VSMC)는 K+ 채널1,전압 게이트 Ca2+ 채널 (VGCC)2의두 가지 유형의 4 가지 유형 이상을 표현하고, 2 가지 유형의 Cl- 채널3, 4개 , 5,상점 운영 Ca2+ 채널6,스트레치 활성화 양이온 채널7,8,그리고 전기 발생 나트륨 - 칼륨 ATPase 펌프9 플라즈마 멤브레인, 모두 될 수있다 Vm의규제에 관여 .
VSMC의 Vm은 루멘 압력에 따라 달라집니다. 비가압 용기에서 Vm은 -50에서 -65 mV까지 다양하지만 가압 동맥 세그먼트에서는 Vm 범위가 -37에서 -47 mV10입니다. 혈관 내 압력의 상승은 VSMC가11을탈분극하게 하고, VGCC 개방에 대한 임계값을 감소시키고, 근조톤(12)의 발달에 기여하는 칼슘 유입을 증가시킨다. 반대로, 수동 또는 비가압 혈관에서, 높은 K+ 채널 활동으로 인해 막 과분극은 VGCC가 열리지 못하게하여 제한된 칼슘 진입과 세포 내 칼슘의 감소를 초래하여 세포 내 칼슘의 감소를 감소시킵니다. 혈관 톤13. 따라서, 루멘 압력의 변화로 인하여 Vm은 혈관 톤 발달에 필수적인 역할을 하는 것으로 보이며, VGCC 및 K+ 채널 모두 Vm의 조절에 중요한 역할을 한다.
V m은 혈관 유형과 종에 따라 다릅니다. Vm은 기니피그 우수한 장간막 동맥 스트립에서 -54±1.3 mV로, 60 mmHg 루멘 압력에서 랫트 중대동맥에서-45±1 mV, 및 -35±1 mV에서 40 mmHg 루멘 압력에서 랫트 자작동맥에서15. 뻗지 않은 쥐 림프근육에서 기록된 쉬잉 Vm은 -48±2 mV16이다. 대뇌 VSMC의 Vm은 말초 동맥에서 보다 더 부정적인. 이에 비해, 고양이 중대동맥은 약 -70 mV의Vm을 가지는 것으로 보고되었으며, 장간막 및 관상동맥은 각각 -49 및-58 mV를 가지는 것으로 보고되었다. 혈관 층에서 V m의 차이는 이온 채널 및 전기 발생 나트륨 칼륨 펌프의 발현 및 기능의 차이를 반영할 수 있다.
Vm의 증가 및 감소는 각각 막 탈분극 및 과분극으로 지칭된다. V m에서 이러한 변경 많은 생리 적 프로세스에 중앙 역할을, 이온 채널 게이팅을 포함 하 여, 세포 신호, 근육 수축, 그리고 행동 잠재적인 전파. 고정 된 압력에서, K+ 채널을 활성화하는 많은 내인성 및 합성 혈관 확장제 화합물은 막 과분극을 일으켜 혈관 확장 1,13을초래합니다. 반대로, 지속된 막 탈분극은 작용제 유도 또는 수용체 매개 혈관수축(19)에서필수적이다. V m은 VGCC13을 통해 Ca2+ 유입을 조절할 뿐만 아니라 내부 매장20,21 및 Ca2+-감도에서 Ca2+의 출시에도 영향을 미치는 중요한 변수입니다. 수축 장치22.
상이한 세포 유형에서 Vm을 기록하는 몇 가지 방법이 있지만, 종면 용기의 미세 전극 몰백 방법으로부터 수집된 데이터는 분리된 VSMC로부터 얻은 데이터보다 더 생리적인 것으로 보인다. 현재 클램프 방법을 사용하여 격리 된 VSMC에서 기록 할 때 Vm은 VSMC24에서자발적인 과도 과분극으로 간주됩니다. 격리된 VSMC는 동기화되지 않으며, 시리즈 저항의 변화는 V m의 진동 거동에기여할 수 있다. 다른 한편으로는, 진동 거동은 Vm이 손상되지 않은 혈관에서 기록될 때 관찰되지 않으며, 아마도 동맥내 동기화에 있는 VSMC 사이의 세포 세포 접촉으로 인해 혈관 전체에 걸쳐 합산되어 안정적인 Vm으로 이어집니다. 24.따라서, 표준 미세 전극 임팔레이 기술을 사용하여 가압 용기로부터 V m의 측정은 생리적 조건에 상대적으로 가깝다.
동기화된 VSMC의 Vm은 혈관 톤과 혈류의 주요 결정요인 중 하나이며 Vm의 변조는 팽창 또는 혈관을 수축. 따라서, Vm을 기록하는 데 관련된 방법론을 이해하는 것이 필수적이다. 이 기사에서는 미세 전극 impalement 방법을 사용하여 조개형 중간 대뇌 동맥 (MCA)에서 V m의 세포 내 기록을 설명합니다. 이 프로토콜은 MCA, 마이크로 전극을 준비하고, 전기계를 설정하고 V m을기록하는 impalement 방법을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한 이 방법을 사용할 때 발생한 대표적인 데이터, 일반적인 문제 및 잠재적인 문제에 대해서도 논의합니다.
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Protocol
수컷 쥐는 UMMC의 동물 관리 시설에 보관되었으며, 이는 실험실 동물 관리 협회 (AAALAC)의 평가 및 인증협회의 승인을 받았습니다. 동물들은 연구 기간 내내 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 동물은 온도가 24±2°C, 습도 수준이 60-80% 및 12h 의 빛/어두운 사이클로 통제된 환경에서 유지되었다. 모든 프로토콜은 UMMC의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 장비 준비
- 이중 채널 차동 전계 증폭기(재료 표참조)를 용기 챔버 가까이에 배치하고 원하는 위치에 배치합니다.
- 증폭기 채널 A 또는 B의 출력을 BNC-BNC 케이블로 디지타이저의 채널 입력에 연결합니다.
- 현미경 조작기에 프로브를 장착하고 현미경과 근사근처에 놓습니다. 녹음 설정은 진동이 없는 테이블에 설치해야 합니다.
- 설명서에 설명된 대로 이 실험을 위해 노브와 스위치를 앰프 전면에 배치합니다.
- 적절한 전극을 통해 배전그라운드를 앰프의 회로 접지에 연결합니다. 마찬가지로 케이지가 앰프의 섀시에 접지되었는지 확인합니다.
2. 마이크로 전극 및 조립의 준비
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borosilicate 유리 마이크로 전극 (재료의 표 참조)를 사용하고 3 M KCl로 채워질 때 8-10mm 테이퍼, 직경 <1 μm 및 80-120 MΩ의 저항을 가지고 유리 팁을 당깁니다.
- 열 = 650 : 다음 설정을 사용하여 짧은 점진적 테이퍼를 달성하기 위해 표준 풀러를 사용; 속도 = 20; 끌어오기 = 25; 시간 = 250 높은 저항과 작은 팁에 대한 두 번 루프. 설정은 계측기별으로 되어 있는지 를 참조하십시오.
참고: 팁 직경 <1 μm은 찔려 세포가 손상될 때 최소한의 손상을 유발합니다.
- 열 = 650 : 다음 설정을 사용하여 짧은 점진적 테이퍼를 달성하기 위해 표준 풀러를 사용; 속도 = 20; 끌어오기 = 25; 시간 = 250 높은 저항과 작은 팁에 대한 두 번 루프. 설정은 계측기별으로 되어 있는지 를 참조하십시오.
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마이크로화이버 주사기를 사용하여 3M KCl로 마이크로 전극을 채웁니다(재료 표 참조).
- 마이크로화이버 주사기의 플런저를 천천히 당기면서 3M KCl을 마이크로 전극에 주입하여 유체가 채워질 공간을 허용하고 마이크로 전극 내부의 기포 형성을 방지합니다.
- 마이크로 전극이 가득 차있을 때까지 채우고 마이크로 전극 홀더에 넣기 전에 기포가 없는지 확인하십시오. 거품이 있는 경우 손가락으로 마이크로 전극을 가볍게 눌러 거품을 제거합니다.
- 주의를 기울여 전극 생크를 지루한 구멍을 통해 홀더에 단단히 밀어 넣습니다. 과잉 유체가 존재하는 경우 조직으로 제거하십시오.
- 전극 홀더 어셈블리를 증폭기 프로브에 연결합니다. 증폭기 매뉴얼에 따라 전극 테스트를 수행하고, 입력 오프셋을 조정하고, 제로 설정을 확인하고, 프로브 입력 누설을 확인합니다.
- 표1과 같이 전극 시험을 사용하여 전극 저항을 측정합니다.
- 작동 전극은 채널 출력에서 1mV/MΩ의 양극 DC 전압 시프트를 표시합니다. 반면에 채널 출력과 미터에 큰 전압이 나타나면 차단또는 파손된 전극을 나타냅니다.
- 레코딩 소프트웨어를 열고 파일에 이름을 할당하고 저장 소프트웨어에서 향후 분석을 위해 저장합니다.
3. 중간 대뇌 동맥의 격리 및 통조림
-
시약을 준비합니다.
- 표2에 기재된 바와 같이 정상 및 저칼슘 생리염액(PSS)을 준비한다.
-
근사학을 준비합니다.
- 근사체 챔버(재료 표참조)를 증류수로 여러 번 헹구어 이물질이 없도록 합니다. 일반 PSS의 5 mL로 챔버를로드합니다.
- 5-10 mL 주사기를 사용하여 여과된 일반 PSS로 두 유리 캐뉼라를 채웁니다. 기포를 전혀 도입하지 않고 캐뉼라 전체와 부속 튜브를 조심스럽게 채웁니다.
- 무딘 집게를 사용하여 각각 반 매듭으로 두 개의 모노필라멘트 나일론 봉합사 (10-0, 0.02 mm)를 준비하십시오.
- 부분적으로 닫힌 봉합사 매듭을 해부 현미경으로 해부 집게를 사용하여 팁에서 약간 떨어진 두 캐뉼러에 놓습니다. 나중에 이 매듭은 미끄러져 서서히 굴절된 동맥 끝에 묶여 혈관을 고정합니다.
-
중간 대뇌 동맥을 분리하고 칸넬화합니다.
- 2-4% 흡입 된 이소플루란을 사용하여 스프라그 다울리 쥐에서 깊은 마취를 유도하십시오.
- 깊은 마취하에 기요틴을 사용하여 쥐를 참수하십시오.
- 조심스럽게 뼈 커터와 가위를 사용하여 두개골을 제거합니다.
- 두개골에서 뇌를 제거하고 얼음에 낮은 칼슘 PSS의 5 mL에 배치합니다.
- 스프링 가위와 집게를 사용하여 뇌에서 내경 100-200 μm의 쥐 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 분기되지 않은 세그먼트를 식별하고 해부하십시오.
- MCA를 미세 한 집게를 사용하여 유리 캐뉼라에 장착하고 일반 PSS를 포함하는 근사계의 봉합사를 조여 고정하십시오.
- MCA 내에서 흐름이 없도록 말단 캐뉼라를 닫습니다.
- 유입 파이펫을 PSS를 보유한 저장소에 연결하여 인라인 압력 변환기로 모니터링되는 내발 압을 제어할 수 있습니다.
- 반전된 현미경 및 이미징 소프트웨어에 장착된 충전 결합 장치 카메라(재료 표참조)를 사용하여 캐뉼형 MCA를 시각화합니다.
- MCA의 축 길이를 강성도 flaccid도 나타나지 않아야 하는 대략적인 길이로 설정합니다.
- O2 (95%)로 목욕 용액 의 평형화 및CO2 (5%) 37 °C에서 적절한 산소화, 온도를 제공하고 7.4에서 pH를 유지합니다.
-
Impale (세포 혈장 막 관통) 혈관 평활근 세포.
- 접지 전극을 연결하고 myograph의 PSS에 침지 유지합니다.
- 용기 챔버를 조명하고 현미경을 통해 목욕 용액에서 미세 전극의 끝을 시각화합니다.
참고: 대안적으로, 이미징 소프트웨어를 갖는 컴퓨터에서 MCA 및 마이크로전극을 시각화할 수 있다. - 마이크로 조작기의 컨트롤을 사용하여 미세 전극의 끝을 혈관의 외벽에 가깝게 이동시다. 마이크로 전극의 미세 조작기와 끝은 조직과 관련하여 안정적인 위치에 있어야합니다.
참고: 실험을 시작하기 전에 멤브레인 전압이 안정화되었는지 확인하십시오. 측정된 전압이 불안정한 경우 전극과 셀 간의 연결이 밀봉되지 않아 누출을 나타냅니다. - 레코딩을 시작합니다.
- 마이크로 전극의 끝을 용기쪽으로 천천히 이동하여 미세 조작기의 과정 또는 미세 제어를 사용하여 용기의 중심을 조준합니다.
참고: 때때로, 마이크로전극 팁이 근육 섬유 막에 접촉할 때 기록에서 작은 편향이 관찰될 수 있다. - 팁이 용기에 근접하면 마이크로 조작기를 사용하여 한 번의 빠른 동작으로 전극을 전진하여 근육의 막을 뚫습니다.
- 이 시점에서 기록되는 Vm의 변경 내용을 관찰하기 시작할 수 있습니다. 마이크로 전극이 세포의 막을 뚫을 때 마이크로 조작기만 두지 마십시오.
참고: 기록 및 기준 전극 사이의 전압 차이는 혈관 내 압력 또는 기타 흥분성 또는 억제 자극의 수준에 따라 0 mV에서 -40 mV 및 -75 mV 사이로 감소합니다. 이 판독값은 현재 세포의 막 횡단 전위 차를 특성화합니다. - 정확한 측정을 위해 VSMC를 손상시키지 않고 선박의 다른 영역에서 단일 용기에 여러 개의 함선을 수행합니다.
- 기록 후, 조작기를 사용하여 한 번의 빠른 움직임으로 마이크로 전극을 제거합니다.
- 추가 분석을 위해 기록을 중지하고 데이터 파일을 저장합니다.
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Representative Results
제시된 방법은 굴절된 용기에서 Vm을 기록하는 데 안정적으로 사용될 수 있다. 뇌에서 MCA를 격리하는 방법을 설명하는 간단한 절차가 그림 1A에제시되어 있습니다. 두개골에서 뇌를 분리 한 후, MCA는 해부하고 낮은 칼슘 PSS를 포함하는 페트리 접시에 배치되었다. 부착 된 결합 조직의 일부는 또한 격리 하는 동안 MCA에 손상을 방지 하기 위해 스프링 가위와 집게를 사용 하 여 MCA와 함께 해부 되었다. 신중하게 결합 조직도 제거되었고 해부된 MCA는 근사체로 옮길 준비가 되었습니다. MCA는 캐뉼라에 장착하고 근사에서 캐뉼라의 양 끝에 봉합매듭을 사용하여 묶었다. 전형적인 마이크로전극 임팔레멘트 방식의 개략적 표현은 도 1B에도시되어 있다. 3M KCl으로 채워진 마이크로 전극은 프로브의 홀더를 통해 전전자계에 연결되었습니다. 전기계의 채널 출력은 BNC-BNC 케이블을 사용하여 디지타이저의 아날로그 입력 채널에 연결되었다. 디지타이저 출력은 기록 소프트웨어에서 신호를 시각화하기 위해 오실로스코프에 더 연결되었습니다. 접지는 전기계의 섀시부터 근기계의 목욕 용액으로 확장된 AgCl 펠릿 와이어를 사용하여 확립됩니다. 마지막으로 컴퓨터 모니터의 레코딩 소프트웨어에서 디지털 트레이스를 시각화했습니다.
MCA를 갓 제조한 따뜻한 PSS로 인큐베이션하고 60 mmHg로 가압하였다. Vm 레코딩에는 톤을 얻는 용기만 사용되었습니다. 용기가 상당한 톤을 얻은 후, 미세 전극은 용기 벽으로 진행되었다. 동맥 직경 및 동맥의 impalement는 비디오 현미경 검사법을 사용하여 가시화되었습니다. 음수 값에 대한 빠른 편향이 있을 때, Vm은 ≥30s에 대해 안정되고, 도 212,15에나타난 바와 같이 전극을 제거할 때 전압이 갑자기 0mV로 돌아오는 경우 성공으로 간주됩니다. 우리의 결과는, 60 mmHg로 가압되는 MCA에서, V m은 ~ -43.2 ± 2.9 mV임을 시사한다.
성공적인 환전 및 Vm 안정화 후, Vm을 변경하는 약물은 목욕에 침류되었고 Vm의 변화는 기록되었다. 우리는 20 mM KCl을 사용하여 탈분극화하고 합성 대형 전도도 칼륨 채널 오프너인 20 μM NS1619를 사용하여 멤브레인을 과분극화했습니다. 우리의 결과는 KCl을 가진 챔버의 관류가 ~ 5.8±0.18 mV에 의해 막을 탈분극화했다는 것을 시사한다. 한편, NS1619를 가진 관류는 ~3.8±0.4 mV로 막을 과분화하였다.
그림 1: 중간 대뇌 동맥의 격리 및 마이크로 전극 impalement 방법을 사용 하 여 막 전위 기록의그림. (A) 스프링 가위를 사용하여 점선을 따라 뇌 또는 결합 조직을 잘라냅니다. 두 유리 캐뉼사이에 MCA를 옮기고 장착하고 PSS로 채워진 근사체 챔버의 봉합사를 사용하여 고정합니다. (B) 3M KCl로 채워진 마이크로 전극이 홀더에 삽입되어 프로브에 연결됩니다. BNC 케이블을 통해 프로브에서 전기계 및 디지타이저로의 트랜스멤브레인 전위 이동 의 변화(BNC 케이블은 전기계의 채널 출력에서 디지타이저의 아날로그 입력으로 연결됨). 디지털화 된 잠재력은 모니터의 레코딩 소프트웨어에서 볼 수 있습니다. 접지는 전이계에서 근기계의 목욕 용액으로 연결된 AgCl 펠릿 와이어를 사용하여 확립됩니다. MCA = 중간 대뇌 동맥; PSS = 생리염 용액; AgCl = 염화물 은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 굴절된 중간 대뇌 동맥에서 마이크로 전극 임팔레이 방법을 사용하여 막 전위 기록. V m의대표 자취. Impalement는 전극 입력 시 음수 값으로 갑작스럽게 편향되는 경우 성공으로 간주되며, Vm은 ≥30s에 대해 안정되고, 전압은 전극을 제거할 때 갑자기 0 mV로 반환됩니다. X축은 시간을 나타내고 Y축은 멤브레인 전위를 나타냅니다. 점선은 선박의 구속 전에 조정된 기준선을 나타냅니다. 초 = 초. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈관 활성제에 혈관활성제에 노출되었을 때 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 멤브레인 전위 변화를 기록합니다. Vm은 혈관활성제에 노출되기 전과 후에 혼질된 중간 대뇌 동맥으로부터의 미세전극 몰백 방법을 사용하여 기록하였다. 샘플 트레이스는 20 μM NS1619-큰 전도도 칼륨 채널 작용제에 대한 응답으로 20 mM KCl 및 (B) 과분극에 반응하여 (A) 탈분극을 나타낸다. (C) KCl 및 NS1619의 적용 전후 Vm의 변화에 대한 요약 막대 그래프. 점선은 휴식 Vm을나타냅니다. 괄호 안에 있는 숫자는 연구에 사용된 혈관의 수를 나타냅니다. Vm 약물 밖으로 세척 되 자마자 기준선에 도달. 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 초 = 초. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 전극 저항을 측정하는 전계의 설정 | |
| 미터 입력 | 채널 A 또는 B |
| 위치 토글 | 에서 |
| 미터 범위 | 200 mV로 전환 |
| 전극 | 목욕탕에서 |
| 모드 | 전극 테스트로 작동 |
| 미터 표시 | 1 mV/MΩ |
표 1: 전극 저항을 측정하는 전계의 설정.
| 화학 물질 | 낮은 칼슘 PSS mM | 일반 PSS mM | 회사 | 카탈로그 | |
| 1개 | Nacl | 119.00 | 119.00 | 시그마 | S7653 |
| 2개 | KCl | 4.70 | 4.70 | 시그마 | P4504 |
| 3개 | MgSO4 | 1.17 | 1.17 | 시그마 | M7506 |
| 4개 | CaCl2 | 0.05 | 1.60 | 시그마 | C3881 |
| 5개 | 헤페스 (주)는 | 5.00 | 5.00 | 시그마 | H7006 |
| 6개 | 포도 당 | 10.00 | 10.00 | 시그마 | G7021 |
| 7명 | NaH2PO4 | 1.18 | 1.18 | 시그마 | S0751 |
| 8개 | 나코3 | 18.00 | 18.00 | 시그마 | S5761 |
| pH: 7.4 | pH: 7.4 |
표 2: 낮은 칼슘 및 정상적인 생리염 용액의 제조에 사용되는 시약.
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Discussion
이 문서에서는 날카로운 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 굴절된 용기 준비로부터 Vm을 기록하는 방법에 대한 필요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 널리 사용되며 광범위한 실험 적 질문에 대답하는 고품질의 일관된 Vm 기록을 제공합니다.
메서드의 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 고려 사항 및 문제 해결 단계가 여기에 설명되어 있습니다. 마이크로 전극의 품질 (선명도 및 저항) 및 침투 하는 셀룰러 프로세스는V m의 안정성과 정확성에 영향을 미칩니다. 신호가 지속적으로 표류하거나 증폭기의 기록 범위 위 또는 아래에 있는 경우 전극이 차단되었거나 팁이 끊어졌을 가능성이 큽입니다. 세포가 부분적이거나 불충분하거나 손상되는 경우 기록된 전위는 0mV로 다시 올라가서 불안정한 신호또는 신호가 생성되지 않습니다. 일부 경우, 셀의 내용물도 매우 높은 저항 전극을 차단할 수 있다. 이러한 모든 문제는 단순히 전극을 새 것으로 교체하여 극복할 수 있습니다.
성공적인 혈연을 위해서는 세포막의 전체 저항이 변하지 않고 측정된 멤브레인 전위가 전극과 멤브레인 사이에 누출되지 않고 안정적으로 유지되도록 해야 합니다. 전극이 안정적인 마이크로 매니퓰레이터에 의해 셀쪽으로 진보하는 것이 중요합니다. 셀의 몇 마이크로미터 이내로 진행되면 팁 전위가 변경되어 감지된 전압이 약간 편향됩니다. 전극의 끝을 손상시키거나 세포막을 스트레칭하지 않으려면 전극의 빠른 발전이 필요합니다. 성공적인 impalement는 막의 나머지 전위 의 주위에 안정화 뒤에 막 전위에 있는 급속한 투하에 의해 특징입니다. 잠재적인 판독값이 변동하는 경우, 전극의 끝이 세포로 나트륨이 누출되어 세포 밖으로 누출되는 멤브레인을 방해하여 점진적인 탈분극을 초래할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 문제점은 접합 전위 및 전극 팁 전위가 Vm 기록에 불필요한 아티팩트를 추가할 수 있다는 것입니다. 접합 전위는 서로 다른 도체가 접촉할 때 발생합니다. 접합 전위는 액체-금속 및 액체-액체의 두 가지 유형이 있습니다. 액체-금속 접합부는 프로브의 팁이 마이크로파이펫내의 전해질과 접촉할 때 형성된다. 액체 접합전위라고도 하는 액체-액체 접합부는 다양한 농도의 두 가지 용액이 접촉할 때 발생합니다. 솔루션 간의 이온 의 확산은 잠재력의 개발에 기여한다. 게다가, 액체와 상호 작용하는 유리 전극 팁의 특성은 팁 전위를 생성 할 수있다. 접합부와 팁 전위를 최소화하기 위해 욕조에서 측정된 전위를 제로화하면 원치 않는 바이어스가 감소할 수 있습니다. impalement 동안, 하나는 내피, 오히려 평활근보다, Vm이 실수로 일부 실험에서 샘플링 될 수있는 가능성을 배제 할 수 없다. 그러나, 연구는 내피 및 VSMC 층이 전기적으로 작은 동맥에 결합되어 유사한 Vm 반응을 나타낸다는 것을 나타낸다23.
궁극적으로, 이 프로세스의 세 단계는 성공적인 녹음을 달성하는 데 중요합니다. 첫째, 선박이 공정 중 손상되지 않도록 적절하게 준비해야 합니다. 둘째, 마이크로 전극은 올바른 전기 적 특성으로 당겨야합니다. 마지막으로, 팁을 깨지 않고 멤브레인의 신속한 결백은 정확한 결과를 위해 매우 중요합니다. 연구원은 전기 생리학, 실행 가능한 미세 전극을 만드는 방법 및 전기계를 설정하고 사용하는 방법을 이해해야합니다.
그 중요성에도 불구하고,이 방법은 다양한 제한이 있습니다. 첫째, 모든 장비를 조달하는 총 비용은 높다 (~ $ 30-40,000). 둘째, 이러한 모든 실험에 신선한 용기가 필요합니다. 따라서 동물은 각 실험에 대해 안락사되어 전체 비용을 추가합니다. 셋째, 대뇌 동맥의 해부, 혈관의 통조림은 지루하고 비싸며 학습 곡선을 가지고 있습니다. 넷째, 마이크로전극, 담백한, 및 Vm을 준비하는 것은 전기생리학에 대한 철저한 이해가 필요하다. 마지막으로, 실험실에서 이 설정을 설정하려면 전담 직원, 시간 및 노력이 필요합니다.
V m은 혈관 톤과 따라서 장기에 대한 혈류를 결정하는 필수적인 전기 생리학적 특성입니다. V m은 뉴런, 내피 및 혈액 구성 요소에서 방출되는 여러 혈관 활성 화학 물질에 의해 변경 될 수 있습니다. 혈관 수축기가 막을 탈분극화하는 동안, 팽창기는 막을 과극화합니다. K+ 채널, VGCC, 나트륨 칼륨 ATPase, Ca2+ ATPase, Cl-채널, 매장 운영 및 스트레치 채널을 포함한 여러 단백질은 Vm을조절한다. 질병 조건에 있는 이 단백질의 변경은 잠재적으로 V m및 이렇게 혈관 톤 및 혈류를 바꿀 수 있었습니다. 마이크로 전극 impalement 방법은 혈관 수축 및 확장기에 대한 응답으로 V m의 변화뿐만 아니라 휴식기록을 기록하는 데 유용합니다. 따라서, 이 방법은 질병과 관련된 정상 및 변경된 Vm을 이해하기 위해 안정적으로 사용될 수 있으며, Vm,혈관 톤 및 혈류를 조절하도록 설계된 약리학적 제제의 개발에 유용할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 UMMC, AHA 과학자 개발 보조금 (13SDG14000006)에서 교내 지원 연구 프로그램 (IRSP)에서 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 말리카르주나 R. Pabbidi에 수여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
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