Summary
Bu makalenin birincil amacı, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemini kullanarak orta serebral arter membran potansiyelinin (Vm) nasıl kaydetilme ayrıntılarını sağlamalıdır. Kanüle orta serebral arter miyojenik tonu elde etmek için dengelenmiş, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotları kullanılarak kazığa olduğunu.
Abstract
Membran potansiyeli (Vm) vasküler pürüzsüz kas hücrelerinin damar tonu ve böylece bir organ kan akışını belirler. Hastalık koşullarında Vm düzenleyen iyon kanalları ve elektrojenik pompalar ifade ve fonksiyon değişiklikleri potansiyel vmdeğiştirebilir, vasküler ton, ve kan akışı. Böylece, Elektrofizyoloji temel bir anlayış ve doğru sağlıklı ve hastalıklı Devletler Vm kaydetmek için gerekli yöntemleri esastır. Bu yöntem v m 'yi geri yüklemek için farklı farmakolojik ajanlar kullanarak modül Vm izin verecektir. Her ne kadar çeşitli yöntemler vardır, her biri avantajları ve dezavantajları ile, bu makalede mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanarak orta serebral arter gibi kanüllü direnç damarlarından Vm kaydetmek için protokoller sağlar. Orta serebral arterlerin bir miyografi odasında miyojenik tonu elde etmek için izin verilir, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotlar kullanılarak kazığa. Vm sinyali, Digitized ve analiz edilen bir elektrometre aracılığıyla toplanır. Bu yöntem, hücrelere zarar vermeden ve membran direncini değiştirmeden bir damar duvarının Vm 'nin doğru bir şekilde okunmasını sağlar.
Introduction
Bir hücrenin membran potansiyeli (Vm), plazma membranında iyonik şarjın göreceli farkını ve membranın bu iyonlara göreli geçirgenliğini ifade eder. Vm , iyonların diferansiyel dağılımı ile üretilir ve iyon kanalları ve pompaları ile korunur. K+, na+ve CL gibi Iyon kanalları, dinlenme Vm'ye önemli ölçüde katkıda bulunur. Vasküler pürüzsüz Kas hücreleri (VSMCs) dört farklı türde K+ kanal1, iki tip gerilim-Gated CA2 + kanal (Vgcc)2, iki tip CL− kanal3, 4 , 5, mağaza tarafından işletilen CA2 + kanallar6, Stretch-aktive Kif kanalları7,8, ve elektrojenik Sodyum-Potasyum ATPaz pompaları9 plazma membranlarında, hepsi olabilir Vmdüzenlenmesi dahil.
VSMCs Vm lümen basıncına bağlıdır. Basınçlı olmayan damarlarda, Vm -50 ila-65 MV arasındadır, ancak basınçlı arter segmentlerinde vm -37-47 MV10arasındadır. İntravasküler basınç yükselmesi VSMCs11depolarize neden olur, vgcc açılış için eşik azalır ve miyokojenik ton gelişimine katkı kalsiyum akımı artar12. Aksine, pasif veya basınçlı olmayan damarlarda, yüksek K+ kanal aktivitesi nedeniyle membran hiperpolarizasyonu, VGCC 'nin açılmasını önleyecek, sınırlı kalsiyum girişine ve hücre içi kalsiyum azalmasına neden olur, daha az katkı vasküler ton13. Böylece, lümen basıncında yapılan değişikliklerden dolayı Vm , vasküler ton gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır ve hem VGCC hem de K+ kanalları vm'nin düzenlenmesi konusunda önemli bir rol oynamaktadır.
Vm gemi tipi ve türler arasında değişir. Vm -54 ± 1,3 MV içinde Gine domuzu üstün mezenterik arter şeritleri14,-45 ± 1 mV Rat orta serebral arterlerde içinde 60 mmHg lümen basıncı12, ve-35 ± 1 mV sıçan parankimal arter içinde 40 mmHg lümen basıncı15. Uzanmış sıçan lenfatik kas içinde kaydedilen istirahat Vm -48 ± 2 mV16. Vm serebral VSMCs periferik arterlerde daha negatiftir. Karşılaştırıldığında, kedi orta serebral arterlerin yaklaşık bir Vm olduğu bildirilmiştir-70 MV, mezenterik ve koroner arterlerin olması bildirildi iken-49 ve-58 MV, sırasıyla17,18. Vasküler yataklarda Vm 'deki farklar iyon kanallarının ve elektrojenik Sodyum-Potasyum pompaların ifade ve fonksiyonlarında farklılıklar gösterebilir.
Vm 'de artar ve azalır, sırasıyla membran depolarizasyon ve hiperpolarizasyon olarak adlandırılır. Vm 'deki bu değişiklikler, iyon kanallı gating, hücre sinyalizasyon, kas kasılma ve eylem potansiyel yayılma gibi birçok fizyolojik süreçte merkezi bir rol oynamaktadır. Sabit bir basınçta, K+ kanallarını aktive eden birçok endojen ve sentetik vazodilatör bileşiği membran hiperpolarizasyonuna neden olur ve vazodikasyon1,13ile sonuçlanır. Tersine, sürekli membran depolarizasyon agonist kaynaklı veya reseptör aracılı vazokonstriksiyon19hayati önem taşımaktadır. Vm yalnızca vgcc13 aracılığıyla CA2 + akımı düzenleyen değil, aynı zamanda CA 2+ ' nın dahili mağazalardan20,21 ve CA2 +-duyarlılığından etkileneceği kritik bir değişkendir kontril cihaz22.
Farklı hücre türlerinden Vm kaydetmek için çeşitli yöntemler olsa da, kanüle damarların mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi toplanan veriler izole vsmcs elde edilen verilerden daha fizyolojik gibi görünüyor. Mevcut kelepçe yöntemlerini kullanarak yalıtılmış VSMC 'den kaydedildiğinde, Vm VSMCs24' te spontan geçici hiperpolarizasyon olarak görülür. Yalıtılmış VSMCs syncytium değildir ve seri direncinde yapılan değişiklikler Vm'nin osiloryumu davranışına katkıda bulunabilir. Öte yandan, vm bozulmamış damarlardan kaydedildiğinde osilasyon davranışı görülmez, muhtemelen arter içinde restorasyonudur olan ve istikrarlı bir Vm 'ye giden gemi boyunca toplanan vsmcs arasında hücre hücresi teması nedeniyle 24. böylece, standart mikroelektrot Kazığa oturtma tekniği kullanılarak basınçlı damarlardan Vm ölçümü, fizyolojik koşullara nispeten yakındır.
Kanule edilen damarlardan vm kayıt hayati bilgi sağlayabilir, restorasyonudur vm vsmcs vasküler ton ve kan akışının önemli belirleyici biridir, ve vm modülasyon dilate ya da bir yol sağlayabilir kan damarlarını sıkı sıkıdır. Böylece, Vmkaydında yer alan metodolojisi anlamak önemlidir. Bu makalede, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanılarak kanüle orta serebral arterlerden (MCAS) Vm hücre içi kayıt açıklanmaktadır. Bu protokol MCAS hazırlamak için nasıl açıklayacaktır, mikroelektrotlar, elektrometre kurmak ve Vmkaydetmek için Kazığa oturtma yöntemi gerçekleştirmek. Ayrıca, temsili veri, bu yöntem ve olası sorunları kullanırken karşılaşılan ortak sorunlar ele alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erkek fareler, laboratuvar hayvan bakımı (AAALAC) değerlendirme ve akreditasyon için dernek tarafından onaylanmış UMMC, hayvan bakım tesisinde yer aldı. Hayvanların çalışma boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişimi vardı. Hayvanlar kontrollü bir ortamda 24 ± 2 °C sıcaklıkta, 60 – 80% ve 12 saat ışık/karanlık Döngülerde nem seviyeleri ile korundu. Tüm protokoller UMMC hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. ekipmanların hazırlanması
- Bir çift kanallı diferansiyel elektrometre amplifikatör yerleştirin ( malzeme tablosunabakın) gemi odasına yakın ve istenilen yerde.
- A veya B amplifikatör kanalının çıkışını BNC-BNC kablosuyla çizim tablası kanalı girişine bağlayın.
- Prob Mikromanipülatör Mount ve mikroskop ve miyografi yakın yerleştirin. Kayıt kurulumunun titreşimsiz bir tabloya yüklenmesi gerekir.
- Manuel olarak açıklandığı gibi, bu deneme için yapılandırdığınız pozisyonlara amplifikatör ön kolu ve anahtarları yerleştirin.
- Uygun bir elektrot ile banyo zemini amplifikatörün devre zemine bağlayın. Benzer şekilde, kafesin amplifikatörün şasisine topraklandığından emin olun.
2. Mikroelektrotlar ve montajın hazırlanması
-
Borosilikat cam mikroelektrotları kullanın (malzeme tablosuna bakın) ve 3 M KCl ile doldurulduğunda, 8 – 10 mm Konik, < 1 μm çapı ve 80 – 120 MΩ direnç için cam ucunu çekin.
- Aşağıdaki ayarları kullanarak kısa aşamalı bir konik elde etmek için standart bir çektirme kullanın: ısı = 650; hız = 20; çekme = 25; zaman = 250 ve daha yüksek dirençleri ve daha küçük ipuçları için iki kez döngü. Ayarlar cihaza özgü olduğu için malzeme tablosuna bakın.
Not: < 1 μm ipucu çapları, impaled sırasında hücreye minimal hasara neden olur.
- Aşağıdaki ayarları kullanarak kısa aşamalı bir konik elde etmek için standart bir çektirme kullanın: ısı = 650; hız = 20; çekme = 25; zaman = 250 ve daha yüksek dirençleri ve daha küçük ipuçları için iki kez döngü. Ayarlar cihaza özgü olduğu için malzeme tablosuna bakın.
-
Mikroelektrot mikrofiber şırınga kullanarak 3 M KCl ile doldurun (bkz. malzeme tablosu).
- Sıvı doldurmak ve mikroelektrot içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için boşluk sağlamak için mikroelektrot içine 3 M KCl enjekte ederken yavaşça mikrofiber şırınga pistonu çekin.
- Mikroelektrot tam kadar doldurun ve mikroelektrot tutucusuna yerleştirmeden önce hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Eğer kabarcıklar varsa, yavaşça kabarcık kaldırmak için bir parmak ile mikroelektrot dokunun.
- Bakım egzersiz, sıkıca Fore delik aracılığıyla tutucu içine elektrot SAP itin. Aşırı sıvı varsa, bir doku ile çıkarın.
- Elektrot tutucu aksamını amplifikatör sondasına bağlayın. Bir elektrot testi gerçekleştirin, giriş uzaklığını ayarlayın, sıfır ayarını doğrulayın ve amplifikatör kılavuzuna göre prob giriş sızıntısını kontrol edin.
- Tablo 1' de gösterildiği gibi bir elektrot testi kullanarak elektrot direncini ölçün.
- Çalışan bir elektrot, kanal çıktısında 1 mV/MΩ pozitif bir DC voltaj kayması gösterir. Öte yandan, kanal çıkışına ve ölçer üzerinde büyük bir voltaj görünüyorsa, bu bir bloke veya kırık elektrot gösterir.
- Kayıt yazılımını açın, dosyaya bir ad atayın ve bir depolama yazılımında gelecekteki analiz için kaydedin.
3. Orta serebral arter izolasyon ve kanülasyon
-
Reaktifleri hazırlama.
- Tablo 2' de açıklandığı gibi normal ve düşük kalsiyum fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlayın.
-
Miyografı hazırlayın.
- Myograph odası durulayın ( malzeme tablosunabakın) enkaz ücretsiz tutmak için birden çok kez damıtılmış su ile. Oda 5 mL normal PSS ile yükleyin.
- 5 – 10 mL şırınga kullanılarak filtrelenmiş normal PSS ile hem cam kanüller doldurun. Dikkatle tüm kanül ve bağlı boru herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmadan doldurun.
- Hazırlamak iki monofilament naylon sütürler (10-0, 0,02 mm) bir yarım düğüm her künt forseps kullanarak.
- Bir diseksiyon mikroskop altında diseksiyon forseps kullanarak her iki kanüller üzerinde biraz uzak ucu kısmen kapalı dikiş knot yerleştirin. Daha sonra bu düğümler kapalı kaydırılacak ve dikkatli bir şekilde kanüle arter üzerine damar güvenli bağlı biter.
-
Orta serebral arter izole ve cannulate.
- 2-4% inhale Isoflurane kullanarak bir Sprague Dawley sıçan derin anestezi teşvik.
- Derin anestezinin altında Giyotin kullanarak sıçan başını atar.
- Kafatasını bir kemik kesici ve bir makas kullanarak dikkatlice çıkarın.
- Kafatasından beyin çıkarın ve buzda düşük kalsiyum PSS 5 mL yerleştirin.
- Yay makas ve forseps kullanarak beynin 100 – 200 μm iç çapı ile sıçan orta serebral arter (MCA) bir undalched segment tanımlamak ve ortadan kaldırır.
- MCA 'Yı cam kanüller üzerine ince forseps kullanarak takın ve normal PSS içeren miyografda sütürler sıkarak sabitleyin.
- Böylece MCAs içinde hiçbir akış olmayacaktır distal kanül kapatın.
- Inlow pipet, bir satır içi basınç dönüştürücünün izlenmesi için intraluminal basınç kontrolü için izin vermek için PSS tutan bir rezervuar bağlayın.
- Tersine çevrilmiş bir mikroskop ve görüntüleme yazılımı üzerine monte edilen, şarj bağlantılı bir cihaz kamerası ( malzeme tablosunabakın) kullanarak kanule edilmiş MCAS 'ı görselleştirin.
- MCA 'nın eksenel uzunluğunu, sert ya da flaccid görünmesi gereken yaklaşık bir uzunlukta ayarlayın.
- O2 ile banyo çözeltisi equilibrate (% 95) ve CO2 (% 5) 37 °C ' de yeterli oksijenasyon, sıcaklık ve pH sağlamak için 7,4.
-
Impale (hücre plazma membranı nüfuz) vasküler pürüzsüz Kas hücreleri.
- Zemin elektrot bağlayın ve myograph PSS içine batırılmış tutun.
- Banyo çözeltisinde mikroelektrot ucunu görselleştirmek için gemi odasını aydınlatın ve mikroskop üzerinden bakabilirsiniz.
Not: Alternatif olarak, bir görüntü yazılımı olan bir bilgisayarda MCA ve mikroelektrot görselleştirebilirsiniz. - Mikroelektrot ucunu kan damarının dış duvara yakın taşımak için mikromanipülatörün denetimlerini kullanın. Mikromanipülatör ve mikroelektrot ucu doku ile ilgili olarak istikrarlı bir konumda olmalıdır.
Not: Denemelere başlamadan önce, membran voltajının stabilize edildiğini onaylayın. Ölçülen voltaj kararsız ise, elektrot ve hücre arasındaki bağlantı mühürlenmez, bir sızıntı olduğunu gösterir. - Kayıt başlasın.
- Mikro elektrot ucunu yavaşça gemiye doğru hareket ettirin ve mikromanipülatörün kurs veya ince kontrolünü kullanarak geminin merkezini hedefliyoruz.
Not: Bazen, mikroelektrot ucu bir kas fiber membran temas ettiğinde kayıtta küçük bir saptırma görülebilir. - Ucu gemi yakın geldiğinde, kas membranı kazığa oturtmak Mikromanipülatör kullanarak bir hızlı hareket içinde elektrot ileriye ilerlemek.
- Bu noktada, kaydedilmiş olan Vm değişiklikleri gözlemlemeye başlayabilirsiniz. Mikroelektrot hücrenin membranı impales zaman Mikromanipülatör dokunmayın.
Not: Kayıt ve referans elektrot arasındaki voltaj farkı, intravasküler basınç veya diğer uyarıcı veya inhibitör uyaranların düzeyine bağlı olarak 0 mV-40 mV ve-75 mV arasında azalır. Bu ölçümler, geçerli hücrenin transmembran potansiyel farkını karakterize eder. - Doğru ölçümler elde etmek için VSMCs zarar vermeden geminin farklı bölgelerinde tek bir gemi üzerinde birden fazla impalements gerçekleştirin.
- Kayıt olduktan sonra, tek bir hızlı harekette mikroelektrot kaldırmak için manipülatör kullanın.
- Kaydı durdurun ve daha fazla analiz için veri dosyalarını kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan yöntem, kanüle edilen damarlarda Vm kaydetmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir. MCA 'yı beyinden nasıl yalıtmayı anlatan kısa bir prosedür Şekil 1a'da sunulmuştur. Beyni kafatasından ayırdıktan sonra, MCA dışarı disseke ve düşük kalsiyum PSS içeren bir petri çanak yerleştirilir. Bağlı olan bağ dokusunun bir kısmı da MCA ile birlikte, izolasyon sırasında MCA 'ya zarar vermemek için yay makas ve forseps kullanarak disseke oldu. Dikkatle, bağ dokusu da kaldırıldı ve disseke MCA myograph aktarmak için hazır oldu. MCA kanüller üzerine monte edilmiş ve myograph kanüller her iki ucunda sütür knot kullanarak bağladı. Tipik bir mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kurulumunun şematik gösterimi Şekil 1B'de gösterilir. 3 M KCl ile dolu bir mikroelektrot, sondaya bir tutucu aracılığıyla elektrometre ile bağlandı. Elektrometre kanal çıkışı, BNC-BNC kablosu kullanarak bir çizim tablası analog giriş kanalına bağlı. Digitizer çıkışı, kayıt yazılımında sinyal görselleştirmek için bir osiloskop daha bağlı. Zemin myograph banyo çözeltisine elektrometre şasiden uzatıldı bir AgCl Pelet tel kullanılarak kurulmuştur. Son olarak, bilgisayar monitörünün kayıt yazılımında dijital izler görselleşmiş.
MCA daha sonra taze hazırlanmış sıcak PSS içinde inkübe ve 60 mmHg basınçlanmış. Vm kayıt için sadece kazanç tonu kullanılan gemiler kullanılmıştır. Gemi önemli ses elde ettikten sonra, mikroelektrot gemi duvarına gelişmiş. Arterinin arter çapı ve kazığa oturtma video mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Negatif değerlere hızlı bir sapma olduğunda ımpalement başarılı kabul edilir, Vm ≥ 30 s için kararlı, ve voltaj aniden 0 MV, Şekil 2' de gösterildiği gibi elektrot kaldırılması üzerine döner 112,15. Sonuçlarımız, 60 mmHg 'ye kadar basınçlanmış bir MCA 'da Vm 'nin ~-43,2 ± 2,9 MV olduğunu göstermektedir.
Başarılı bir kazığa oturtma ve vm stabilizasyonu sonrasında, vm 'i değiştiren ilaçlar banyo ve vm 'de değişiklikler yapıldı. Biz 20 mM KCl depolarize ve 20 μM NS1619, sentetik büyük iletkenlik Potasyum kanal açacağı, hiperpolarize membran için kullanılır. Sonuçlarımız, KCl ile odanın perfüzyonunu ~ 5,8 ± 0,18 mV ile membranı depolarize ettiğini göstermektedir. Öte yandan, perfüzyon NS1619 ile membran hiperpolarize ~ 3,8 ± 0,4 mV.
Resim 1: Orta serebral arterlerin izolasyonunda bir Illustration ve mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanılarak membran potansiyelinin kaydı. (A) yay makas kullanarak, noktalı çizgiler boyunca beyin veya bağ dokusu kesti. MCA 'Yı iki cam kanüller arasında aktarın ve bağlayın ve PSS ile dolu miyografi odasında sütürler kullanarak sabitleyin. (B) 3 M KCl ile dolu bir mikroelektrot tutucuya yerleştirilir ve sondaya bağlanır. Prob bir elektrometre ve çizim tablası bir BNC kablo üzerinden transmembran potansiyel seyahat değişiklikleri (BNC kablosu elektrometre kanal çıkışından ve bir çizim tablası analog girişe bağlanır). Dijimleştirilmiş potansiyel, monitördeki kayıt yazılımında görülür. Zemin myograph banyo çözeltisi elektrometre bağlı bir AgCl Pelet tel kullanılarak kurulmuştur. MCA = orta serebral arter; PSS = fizyolojik tuz çözeltisi; AgCl = gümüş klorür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: kanüle orta serebral arterlerden mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanılarak membran potansiyelinin kaydedilmesi. Vm'nin temsili izi. Elektrot girişinde negatif değerlere ani bir sapma varsa, Vm , ≥ 30 s için kararlı olup, elektrodu çıkarıldıktan sonra voltaj 0 MV 'ye döner. X ekseni zamanı temsil eder ve Y ekseni membran potansiyelini temsil eder. Noktalı çizgi, geminin Kazığa oturtma öncesinde ayarlanan taban çizgisini temsil eder. Saniye =. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: damarların vazoaktif ajanlara maruz kaldığında mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemini kullanarak membran potansiyeline yapılan değişikliklerin kaydedilmesi. Vm , vazoaktif ajanlara maruz kaldıktan önce ve sonra kanüle orta serebral arterlerden mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanılarak kaydedildi. Örnek izleme, 20 μM NS1619-büyük iletkenlik potasyum kanalı agonist 'e yanıt olarak (a) depolarizasyon ile yirmi mm KCL ve (B) hiperpolarizasyon ifadesini temsil eder. (C) KCL ve NS1619 uygulamadan önce ve sonra Vm değişikliklerinin Özet çubuk grafiği. Noktalı çizgi dinlenme Vmtemsil eder. Parantez içindeki sayı, çalışmada kullanılan gemiler sayısını temsil eder. İlaç yıkıldığında Vm 'nin taban çizgisine ulaştığını unutmayın. Hata çubuğu ortalama standart hata temsil eder. Saniye =. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Elektrot direnci ölçmek için elektrometre ayarları | |
| Sayaç girişi | Kanal A veya B |
| Pozisyon geçiş | Inç |
| Metre aralığı | 200 mV için geçiş |
| Elektrot | Banyoda |
| Modu | Elektrot testine çalışır |
| Ölçer göstergesi | 1 mV/MΩ |
Tablo 1: elektrot direncini ölçmek için elektrometre ayarları.
| Kimyasal | düşük kalsiyum PSS mM | Normal PSS mM | Şirket | Katalog | |
| 1 | Nacl | 119,00 | 119,00 | Sigma | S7653 |
| 2 | Kartal | 4,70 | 4,70 | Sigma | P4504 |
| 3 | MgSO4 | 1,17 | 1,17 | Sigma | M7506 |
| 4 | CaCl2 | 0,05 | 1,60 | Sigma | C3881 |
| 5 | HEPES | 5,00 | 5,00 | Sigma | H7006 |
| 6 | Glikoz | 10,00 | 10,00 | Sigma | G7021 |
| 7 | NaH2Po4 | 1,18 | 1,18 | Sigma | S0751 |
| 8 | NaHCO3 | 18,00 | 18,00 | Sigma | S5761 |
| pH: 7,4 | pH: 7,4 |
Tablo 2: düşük kalsiyum ve normal fizyolojik tuz çözeltisi hazırlanması için kullanılan reaktifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, bir kanüle damar hazırlama Vm kaydetmek için keskin bir mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanmak için gerekli adımları sağlar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılır ve yüksek kaliteli, tutarlı bir dizi deneysel soruya cevap Vm kayıtları sunuyor.
Bazı kritik hususlar ve sorun giderme adımları, yöntemin başarısını sağlamak için burada açıklanmıştır. Mikroelektrot (netlik ve direnç) ve hücresel Proses kalitesi Vm'nin stabilitesini ve doğruluğunu etkiler. Sinyal sürekli olarak sürükleniyor veya amplifikatörün kayıt aralığının altında veya altında ise, elektrotun engellendiği veya uç bozulmuş olması muhtemeldir. Eğer Kazığa oturtma sadece kısmi, yetersiz veya zarar hücre ise, kaydedilmiş potansiyel geri 0 MV kararsız bir sinyal veya sinyal sonucu tırmanıyor. Bazı durumlarda, hücrenin içeriği de çok yüksek direnç elektrot engelleyebilir. Tüm bu sorunlar sadece yeni bir ile elektrot yerine tarafından üstesinden gelebilir.
Başarılı bir impalement için, bir hücre zarının toplam direncinin değiştirilmediğinden emin olmalıdır ve ölçülen membran potansiyeli elektrot ve membran arasında hiçbir sızıntı olmadan kararlı. Elektrot, istikrarlı bir Mikromanipülatör tarafından hücreye doğru ilerlemiş olması önemlidir. Hücrenin birkaç mikrometre içinde ilerlediğinizde, ipucu potansiyeli algılanan voltajda hafif bir sapmaya neden olacak şekilde değişecek. Elektrot ucunun zarar görmesini önlemek için veya hücre membranı germe, elektrot hızlı ilerlemesi gereklidir. Başarılı Kazığa oturtma membranın dinlenme potansiyeli etrafında bir stabilizasyon takip membran potansiyeli hızlı bir düşüş ile karakterize edilir. Eğer potansiyel okuma dalgalanır, elektrotun ucu hücre ve potasyum içine sızıntı için sodyum neden membranı bozdu mümkündür hücreden kaçak, Progressive depolarizasyon ile sonuçlanan. Bu yöntemde başka bir sorun, kavşak potansiyelleri ve elektrot ucu potansiyelleri Vm kayıt için gereksiz bir artifakı ekleyebilirsiniz olmasıdır. Farklı iletkenler temas ettiğinde kavşak potansiyelleri meydana gelir. Kavşak potansiyelleri, sıvı-metal ve sıvı-sıvı iki farklı türde vardır. Prob ucu mikropipetteki elektrolit ile bağlantı kurduğunda sıvı-metal kavşak oluşur. Sıvı kavşak potansiyeli olarak da adlandırılan sıvı-sıvı kavşak, farklı konsantrasyonlarda iki solüsyonun temas ettiğinde meydana gelir. Çözümler arasındaki iyonlarının difüzyon potansiyelinin gelişmesine katkıda bulunur. Ayrıca, cam elektrot ucunun sıvı ile etkileşiminin özellikleri ipucu potansiyelleri üretebilir. Kavşak yanı sıra uç potansiyelleri en aza indirmek için, banyoda ölçülen potansiyeli sıfırlama istenmeyen önyargı azaltabilir. İmpalement sırasında, bir olasılık, endotel, yerine pürüzsüz Kas, Vm yanlışlıkla bazı deneyler örneklenen olabilir kural olamaz. Ancak çalışmalar, endotelyum ve VSMC tabakalarının küçük arteriollarda elektriksel olarak birleştirildiğini ve benzer Vm yanıtlarını23gösterdiğini göstermektedir.
Sonuçta, bu süreçte üç adım başarılı kayıtlar elde etmek için önemlidir. İlk olarak, gemiler uygun şekilde hazırlanmalı ve bu süreçte hasar görmediğinden emin olmalısınız. İkincisi, mikroelektrotlar doğru elektrik özelliklerine çekilmelidir. Son olarak, uç kırmadan membranın hızlı Kazığa oturtma doğru sonuçlar için çok önemlidir. Araştırmacı Elektrofizyoloji anlamak gerekir, nasıl uygun mikroelektrotlar oluşturmak için, ve nasıl kurmak ve bir elektrometre kullanmak.
Önemini rağmen, bu yöntem çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, tüm ekipmanları tedarik etmek için toplam maliyet yüksek (~ $30-40000). İkinci olarak, tüm bu deneyler için taze gemiler gereklidir; Bu nedenle bir hayvan, genel maliyetine ekleyerek, her deney için ötenize edilir. Üçüncü olarak, serebral arterlerin diseksiyonu, damarların kanülasyon sıkıcı, pahalı ve bir öğrenme eğrisi vardır. Dördüncü olarak, mikroelektrotlar, impalement ve kayıt Vm hazırlanması Elektrofizyoloji kapsamlı bir anlayış gerektirir. Son olarak, laboratuarda bu kurmak için özel personel, zaman ve çaba gerektirir.
Vm vasküler tonu belirleyen ve böylece bir organa kan akışını sağlayan temel bir elektrofizyolojik özelliktir. Vm , nöronların, endotelyum ve kan bileşenlerinden çıkan birkaç vazoaktif kimyasallar tarafından değiştirilebilir. Vasoconstrictors membranı depolarize ederken, dilatörler membran hiperpolarize. K+ kanallar, VGCC, Sodyum Potasyum ATPaz, CA2 + ATPase, CL kanalları, mağaza tarafından işletilen ve streç kanalları dahil olmak üzere çeşitli proteinler Vmdüzenler. Hastalık koşullarında bu proteinlerin herhangi birinde değişiklik potansiyel Vm ve böylece vasküler ton ve kan akışını değiştirebilir. Mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi, vasoconstrictors ve dilatörlere yanıt olarak Vm 'deki değişikliklerin yanı sıra istirahat kaydetmek için yararlıdır. Bu nedenle, bu yöntem, normal ve değiştirilmiş Vm hastalığı ile ilişkili anlamak için güvenilir bir şekilde kullanılabilir ve vm, vasküler ton ve kan akışını modülate tasarlanmış farmakolojik ajanlar gelişiminde yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma UMMC gelen Intramural destek araştırma programı (IRP) tarafından hibe tarafından kısmen desteklenmektedir, AHA Scientist kalkınma Grant (13, 14000006) coşkun R. Pabbidi verilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments | |||
| Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
| Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
| Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
| Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
| Electrophysiology Instruments | |||
| Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
| Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
| In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
| Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
| Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
| Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
| Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
| Softwares | |||
| Clampex 10 | Molecular devices | ||
| p Clamp 10 | Molecular devices | ||
| Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
| Chemicals | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
References
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
- Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
- Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
- Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
- Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
- Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
- Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
- Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
- Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , Taylor & Francis. (1993).
- Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
- Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
- Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
- Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
- Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
- Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
- Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
- Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
- Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
- Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
- Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
- Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T.
