Надежных и воспроизводимых критического размера сегментарный бедренной дефект модель крыс, стабилизировалось с пользовательской внешних фиксаторов
Summary
В естественных условиях млекопитающих модели критического размера костных дефектов имеют важное значение для исследователей, изучая механизмы заживления и ортопедической терапии. Здесь мы представляем собой протокол для создания воспроизводимых, сегментарный, бедренной дефектов в крыс, стабилизировалась, с использованием внешней фиксации.
Abstract
Ортопедические исследования опирается на животных моделей для изучения механизмов кости Исцеление в естественных условиях , а также исследовать новые методы лечения. Критического размера сегментарный дефекты являются сложными для лечения клинически, и исследовательские усилия могли бы извлечь пользу из надежной, амбулаторный малых животных модели сегментарный бедренной дефекта. В этом исследовании мы представляем оптимизированные хирургический протокол для создания последовательного и воспроизводимые критический дефект диафизарных 5 мм в крыса бедра, стабилизировалось с внешних фиксаторов. Диафизарных ostectomy была выполнена с использованием пользовательских джиг поставить 4 Kirschner провода bicortically, которые были стабилизированы с устройством адаптированы внешних фиксаторов. Осциллирующий пилой был использован для создания дефекта. Коллагеновая губка одиночку или коллагена губкой, смоченной в rhBMP-2 был имплантирован в дефект, и исцеление кости контролируется более 12 недель, используя рентгенограммы. После 12 недель крысы были принесены в жертву, и гистологический анализ проводился на подакцизные управления и лечить бедра. Дефектов костей, содержащие только коллагеновая губка привело к не союз, в то время как лечение rhBMP-2 принесли формирования периостальная черствым и новые костного ремоделирования. Также восстановленные после имплантации и внешней фиксации животных оказалась успешной в стабилизации бедренной дефектов более 12 недель. Этот обтекаемый хирургические модель может применяться легко изучать кости Исцеление и тестировать новые ортопедические биоматериалов и регенеративной терапии в естественных условиях.
Introduction
Ортопедической травматологии фокусируется на лечении широкого спектра сложных переломов. Критические диафизарных сегментарный кость, которую дефекты доказали трудным для лечения клинически обусловлено снижение регенерационной способности окружающие мышцы и надкостницы, а также отказ от локализованных ангиогенеза1. Современные методы включают постановляющей части фиксации с костной пластикой, задержкой подсадка кости (Masquelet), кости транспорта, фьюжн или ампутация2,3,4. У большинства пациентов, которые имеют амбулаторного функции сохранены после их травмы, с хорошо функционирующей Дистальная конечностей конечности бабло, несомненно, лучшее лечение вариант5. Эти аварийные процедуры часто требуют поэтапного хирургических вмешательств течение длительного лечения. Некоторые авторы полагают, что выше по сравнению с внутренней фиксации для этих приложений из-за повреждения снижение тканей во время имплантации, уменьшилось имплантированных площадь поверхности и увеличение послеоперационной приспособляемость этой внешней фиксации Фиксатор пластинчатый6. Однако перспективных рандомизированное контролируемое испытание ведется в настоящее время чтобы помочь прояснить этот спор внутренней против внешней фиксации в тяжелой открытых переломов голени7. К сожалению с либо лечения выбран, значительных осложнений и провал ставки сохраняются8,9. С либо метод лечения, что касается потери сегментарный кости хирург должны бороться с сегментарный диафизарных дефекты, которые представляют серьезные проблемы. Исправления сегментарный дефектов необходимо максимизировать кости стабилизации и одновременно повысить Остеогенные процесс10,11.
Благодаря клиническое значение, но ниже объема, критического размера диафизарных сегментарный дефектов эффективной, воспроизводимые животной модели необходимо, чтобы исследовательские группы для продвижения методов лечения и в конечном итоге улучшить клинические исходы. Исследователи должны учиться в vivo физиологическое заживление механизмов в млекопитающих животных модели. Хотя такие модели внешней фиксации уже существуют12,13,14,15, мы надеемся обеспечить более надежный метод для профсоюзов, в необработанной животных, уменьшение расходов путем выбора материалы доступные фиксатором и наброски прямой хирургический протокол для легко приложения для будущих исследований. Основная цель настоящего Протокола заключается в создание надежных и воспроизводимых модель критический дефект диафизарных крыс. Процедура оценивалась путем оценки стабилизации и кости Исцеление в крыса бедра свыше 12 недель. Вторичные цели включали: сделать доступным модель стоимости для максимально эффективной, упрощение хирургический подход и стабилизации и обеспечение этического заботу о животных. Авторы и исследовательская группа провела предварительные эксперименты с широкий спектр разных биоматериалов и потенциальных регенеративной терапии для улучшения исцеление в этой сегментарный дефекта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Малые животные модели ортопедических травм, таких как полный переломов включить исследования, который исследует механизмы остеогенез и оценки терапевтический потенциал биоматериалов20. Это исследование представляет крыса сегментарный дефект модель стабилизировать пос?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH оборудование Грант 1S10OD023676-01 с дополнительной поддержки, предоставляемой через университет Висконсин отделения ортопедии и реабилитации и школа медицины и общественного здравоохранения. Мы хотим отметить UW Карбоне рака центр поддержки Грант Р30 CA014520 и использования их маленький животное визуализации объекта, а также NIH обучения Грант 5T35OD011078-08 для поддержки H. Мартина. Мы также благодарим Майкла и Мэри Сью Шеннон за их поддержку опорно регенерации партнерства.
Materials
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2×2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4×4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
Referências
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, &. #. 3. 2. 1. ;., Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R. The mechanics of external fixation. The Musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery. 3 (1), 13-29 (2007).
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children’s Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- . . Living lmage Software. , (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
