Summary
このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。
Abstract
成体神経新生は、歯状ジャイル(DG)の顆粒帯(SGZ)で新たに活性化された神経幹細胞(NSC)が新しいニューロンを生成し、既存の神経回路に統合し、特定の海馬機能に寄与する動的なプロセスです。.重要なことに、成人の神経新生は環境刺激の影響を非常に受けやすく、様々な認知機能の活性依存調節を可能にする。様々な脳領域からの神経回路の広大な範囲は、これらの複雑な認知機能を調整します。したがって、特定の神経回路が成人の神経新生を調節する方法を理解することが重要です。ここでは、げっ歯類のNSCと新生児の子孫を調節するデザイナー薬(DREADDs)技術によって排他的に活性化されるデザイナー受容体を用いて神経回路活動を操作するプロトコルについて説明する。この包括的なプロトコルには、ウイルス粒子の立体注射、特定の神経回路の化学的刺激、チミジンアナログ投与、組織処理、免疫蛍光標識、共焦点イメージング、およびイメージングが含まれます。神経前駆細胞の様々な段階の分析。このプロトコルは、NSCとその子孫を視覚化するために使用される抗原検索技術に関する詳細な指示を提供し、クロザピンN-酸化物(CNO)またはCNO含有飲料水を使用して脳回路を調節する簡単で効果的な方法を説明し、DREADDs 発現ウイルス。このプロトコルの強みは、NSCに由来する成人の神経新生に影響を与える多様な神経回路を研究する適応性にあります。
Introduction
成人神経新生は、新しいニューロンが成人で生まれ、既存のニューラルネットワーク1に統合される生物学的プロセスである。ヒトでは、このプロセスは海馬の歯状ジャイル(DG)で起こり、そこでは毎日約1,400個の新しい細胞が2日に生まれる。これらの細胞は、神経原性ニッチを有するDGの内側の部分に存在し、粒状帯(SGZ)と呼ぶ。ここでは、海馬成人神経幹細胞(NSC)は、学習と記憶、気分調節、ストレス応答を含む特定の脳機能の調節に寄与する完全に機能するニューロンになるために複雑な発達過程を経る3 ,4,5,6.行動に影響を与えるために、成人NSCは、局所的および遠位的な化学的手がかりの配列に応答することにより、活動依存的な方法で様々な外部刺激によって高度に規制されています。これらの化学的手がかりは、神経伝達物質と神経調節剤を含み、様々な脳領域から回路固有の方法で作用します。重要なことに、NSC上のこれらの化学的手がかりの回路広い収束は、幹細胞の活性化、分化、および運命の決定のユニークで正確な調節を可能にします。
生体内の成人NSCの回路調節を調知する最も効果的な方法の1つは、免疫蛍光解析と回路広い操作を組み合わせることによってです。成体NSCの免疫蛍光分析は、特定の分子マーカーに対する抗体が成人NSCの発達段階を示すために使用される一般的に利用される技術である。これらのマーカーには、ラジアルグリア細胞および初期神経前駆マーカーとしてのネスチン、中間前駆マーカーとしてのTbr2、神経芽細胞および未熟ニューロンマーカー7としてのdcxが含まれる。さらに、BrdU、CidU、Idu、およびEduなどのチミジン類似体を投与することにより、S相を受けている細胞集団を個別に標識および可視化することができ、8、9、10である。これら2つのアプローチを組み合わせることで、特定の発達段階での増殖がどのように調節されるのか、様々な手がかりがNSC分化や神経新生にどのように影響するかまで、幅広い疑問を調査することができます。
電気刺激、光遺伝学、化学遺伝学などの神経回路を効果的に操作するには、それぞれに長所と短所を持ついくつかのオプションがあります。電気刺激は、電極が後で標的脳領域を調節するために電気信号を送信するために使用される特定の脳領域に移植される広範な手術を伴う。ただし、このアプローチにはセルラーと回路の両方の特異性が欠けています。光遺伝学は、埋め込まれた光ファイバーを通して放出されるレーザーによって刺激される光活性化受容体をコードするウイルス粒子の送達を含むが、広範な操作、大きなコスト、および複雑な手術を必要とする11。化学遺伝学は、デザイナー薬またはDREADDsによって排他的に活性化されるデザイナー受容体をコードするウイルス粒子の送達を含み、その後、クロザピンN-オキシド(CNO)として知られている特定の生物学的不活性リガンドによって活性化される12.DREADDを利用して成人NSCを調節する局所的な神経回路を操作する利点は、CNO管理の容易さと様々な経路にあります。これにより、動物の取り扱いを減らして時間のかかるアプローチが可能となり、神経回路を調節するための長期研究に容易に適応できます。
このプロトコルに記載されているアプローチは、免疫蛍光技術と回路操作の両方を組み合わせた成人海馬神経新生の回路調節を正常に調知するために必要な様々なプロトコルの包括的なコレクションです。化学遺伝学を使用して。以下のプロトコルに記載の方法は、成体神経新生に対するそれらの調節機能を決定するために、生体内で同時に1つまたは複数の回路を刺激または阻害するのに適している。この方法は、質問に高度な時間分解能が必要ない場合に最適です。特定の周波数での刺激/阻害の正確な時間的制御を必要とする質問は、光遺伝学13、14を使用してより良い対処することができる。ここで説明するアプローチは、特にストレスが主要な懸念事項である場合、最小限の動物の取り扱いを伴う長期的な研究に容易に適合する。
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Protocol
動物の被験者を含むすべての手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒルの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. ウイルス粒子の立体注射
- 問題の神経回路を特定します。これにより、次の手順で使用されるウイルスとマウスラインが判別されます。
注:この例では、反対方の苔細胞突起が刺激され、成人の神経新生に及ぼす影響を分析する。AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherryをコードするウイルス粒子は、5ht2A-Creマウス15のDGに送達される。 - メロキシカム(5mg/kg、皮下)を少なくとも30分術前に投与し、8週齢の雄ヘテロ接合5ht2A-Creマウスに先制鎮鎮鎮薬を提供する。
- 呼吸が遅くなり、マウスがイソファルラン室を使用して意識不明になるまで、4%のイソファラン酸素混合物を使用してマウスを麻酔する。つま先はマウスをつまんで応答しないほど良い。
- 熱調節のための小さな動物の加熱パッドのステレオタックスにマウスを置き、各目に目の潤滑剤を適用します。動物がステレオタックスの中に入ったら、イソフランを1.5%に減らす。
注:この段階の間に耳棒の配置は重要である。イヤーバーの配置後に頭部が水平であることを確認します。より詳細な手順は、ガイガーら16. - 脱毛製品を頭の上に置き、最大1分間座らせます。エタノール拭きで頭を拭いて髪を取り除きます。髪が完全に取り除かれていない場合は、頭の上が毛がないまでこのプロセスを繰り返します。
- 少なくとも3回ポビドネヨウ素溶液で毛のない領域を消毒する。
- 頭の毛のない皮膚に局所リドカイン溶液を置き、1分間待つ. 頭から局所リドカインを取り出し、外科的メスを使用して耳の始まりから耳の始まりまで頭に小さな切開を行います。
注:つま先は、切開を行う前に完全に鎮静されていることを確認するために、マウスをつまみます。 - 頭皮を引き込み、ブレグマが容易に識別できるようになるまで、殺菌された綿棒を使用して頭の上の結合組織をきれいにします。
- ブレグマを見つけて、ブレグマとラムダが両方の座標にドリルを配置し、それらが揃っていることを保証することによって、両方が同じ平面にあるようにヘッドを調整します。さらに、ブレグマとラムダの間の領域の左右にドリルを配置して、左右の半球を位置合わせします。
注:この手順は非常に重要です。不適切に位置合わせされたヘッドの配置は、ステレオタキスティック座標を破壊します。 - 0.5 mm ドリル ビットを使用してブレグマから次の座標でドリル: 前軸 (AP) -2.00 mm、中間横軸 (ML) +1.50 mm 直径ドリル穴に 0.5 mm から 1 mm を作成します。
注:問題の回路に固有の座標を使用して、この手順を変更します。この例では、苔状細胞を含む一方的な歯状のジャイルを標的とし、反対側の成体神経幹細胞に及ぼす影響を決定する。 - ドリルを 5 μL シリンジと 26-33 G 針に切り替えます。ブレグマでゼロにし、前軸-2.00mm、中間横軸-1.50mm、背部腹部軸-2.3mmのドリル穴に針を入れて、次の座標で注入する。
- ウイルスコアまたは商業源から適切な半球にアデノ随伴ウイルス(AAV)の500 nLを注入し、注入ポンプ(材料の表)を使用して50−100 nL/minで。脳から針をゆっくりと取り除く前に、少なくとも5分のポスト注射を待ちます。
注:これらの座標は、マウスの年齢とサイズに基づいて調整が必要な場合があります。特定のウイルス血清型は、異なる拡散パターンを有し、完全な実験の前にウイルスの広がりをテストするためにパイロット実験を行うことが最善である。 - 生理生理を用いて切開部の周りの頭皮と皮膚をきれいにし、その後、ピンセットと一緒に皮膚を保持しながら、組織接着剤(材料のテーブル)を使用して切開をシールします。マウスがアクティブになるまで、加熱パッドでの回復中のモニタリング、創傷に鎮痛薬を塗布する、鎮痛剤を2日間投与するなど、術後のすべての手順を実行します。
注:多くの実験は、適切なウイルス発現のためのウイルス注入後2−4週間の待ち時間を必要とします。
2. クロザピンN酸化物管理
- ジメチルスルホキシド(DMSO)の100μLでCNOの10mgを溶解し、渦を作ることによってストックCNO溶液を調出す。
注:溶液が完全に溶解しない場合は、DMSOの体積を増やしますが、DMSOが多すぎると水が苦くなることがあります。CNO水溶液では0.1%DMSO、または200 mL溶液のDMSOが200μLを超えないようにしてください。CNOストック溶液は、最大2週間-20°Cで保存することができます。 - 10 mg/100 μL CNO ストック溶液の 10-50 μL を水の 200 mL ごとに追加し、最終的な濃度を 1−5 mg/200 mL にします。CNO水の混合物を毎日新鮮に準備します。
注:いくつかのグループは、マウスが飲酒を控えている場合、苦味をマスクするために水の中で1%サッカリンまで補充しています。調査した回路は、活性化の程度に基づいて異なる応答を示した。一般に、1 mg CNO/200 mL は、ほとんどの回路を刺激するのに十分です 17. - CNO溶液をホイルカバーまたは光保護容器に入れ、ステップ1.13から立体注射から回復してから2週間後にマウスに投与する際に、4日間にわたって投与する。
注:CNO は光に敏感です。プロセス全体の間に光への露出を減らす。 - 新鮮なCNOソリューションを準備する際に、毎日消費されたCNO水溶液を測定し、記録します。平均して、成体マウスは約4mLのCNO水混合物を消費する。さらに、毎日マウスの体重を記録し、飲んでいることを確認します。
- 各実験に適切なコントロールが使用されていることを確認します。CNO コントロールと DREADD コントロールの両方を含めます。実験的なセットアップの例としては、(1)車両+自律水陸両用車(AAV)、ウイルスレポーターなしDREADD、(2)CNO +AAV、および(3)CNO + AAV DREADDが含まれます。
注:すべてのグループには、ソリューションに DMSO が含まれます。動物は0.1%未満のDMSOを受けているため、DMSOコントロールは含まれませんが、これはマウスの成体神経幹細胞に悪影響を及ぼすことが示されていません。飲料水でのDMSO使用に関する懸念がある場合は、DMSOと生理塩水の制御を追加しません。
3. チミジンアナログラベリング
-
組織採取日に、CNOを投与した4日後に、一連のチミジンアナログ、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(Edu)の食前注射を行うことにより増殖細胞を標識する。
注:このプロトコルは Edu を使用します。しかし、ブルドゥ、イドゥ、シドゥ8を含む増殖細胞集団を効率的に標識できるいくつかのチミジン類似体がある。- エドゥの重量を量り、15分間ローターに置くことによって4mg/mLで塩化ナトリウム注入液0.9%を溶解する。
注:チミジンアナログは毒性と光に敏感です。アルミ箔を使用した光暴露による溶液の取り扱いおよびカバー時には、材料安全データシート(MSDS)に従ってください。 - 4mg/mL Edu溶液の体重の40mg/kgまたは0.1 mL/10gでエドゥを2時間毎に4回投与する。
注:50 mg/kg を超える用量は飽和レベルに近く到達し、標識された増殖細胞の量を大幅に増加させない18.不適切な標識が結果を歪めることができるので、すべてのマウスが同じ量のEdu注射を受け取ることが重要です。
- エドゥの重量を量り、15分間ローターに置くことによって4mg/mLで塩化ナトリウム注入液0.9%を溶解する。
4. 組織の調製と処理
- 最後のEdu注射の2時間後に、呼吸が著しく減少し、つま先のピンチが完全に鎮静されるまで、イソファルラン室を使用してマウスを麻酔する。
- 針を使用して表面にマウスを固定し、心臓を露出させる小さな切開を行います。左大腸に25Gの針を挿入し、肝臓組織がクリアされるまで1−4 mL/分の流量でリン酸緩衝生理食生(PBS)溶液で心筋灌流のための右心室を切断します。
- 灌流溶液を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に切り替え、脳組織を固定するために15−20 mLの周りに注入します。
注:灌流プロセスに関するより詳細な手順は、ゲージら19.動物の揺れは、適切に行われたときに観察されます。 - 大きなはさみを使って頭部を取り外し、頭蓋骨から脳を解放するために一連の注意深い切開を行う。脳組織を4°Cで一晩4%PFAに保存し、固定を継続します。
- 4%のPFA溶液から脳組織を取り出し、PBSの10%ショ糖溶液に入れ、4°Cで24時間組織を凍結保護する。次に、組織を30%ショ糖PBS溶液に移し、断面前に4°Cでさらに24時間を行います。
注:マイクロトーム断面の準備ができたら、脳組織はスクロースに沈む。脳組織は、30%ショ糖に長期保存することができる。 - マイクロトームを用いて40μmのセクションで脳組織を冠状に切り分ける。歯付きジャイルの始まりから始まり、ブレグマから約-1.20 mm、プレートの後に終わるセクションを収集し、最初のセクションが最も前部であり、最後のセクションが最も後部である。DGと開始組織採取座標を正確に識別するには、マウスの脳アトラスを参照してください。
- 不凍液で満たされた48ウェルプレートに6の行に各セクションをシリアルで保存します(表1)。
| 不凍液 | エチレングリコール 150 mL + スクロース 150 g + 500 mL 溶液用 500 mL 0.1 M PB に充填 |
| クレートバッファ | クエン酸ストックの9 mL + 41 mLの三硝酸バッファー + ddH2Oの450 mL |
| クエン酸ストック | [0.1 M]クエン酸 21 g/1 L ddH2O |
| ク硝酸三ナトリウムストック | [0.1 M]クチ酸三ナトリウム 29.4 g/1 L ddH2O |
| トリスバッファド生理生理 - トリトン (TBS -トリトン) | 0.05% 100-x トリトン(TBS) |
| パーミア化バッファー | TBSの0.5% 100-xトリトン |
| ブロックバッファ | 0.33 mL 10 mL TBS-トリトンのドンキーセラム |
| エドゥ反応溶液 | CuSO 4・5H2O溶液を[0.1M]トリスpH 8.5の4mL溶液にCuSO4・5H2Oを1mg添加して作る。次に、600 μM Alexa488-azide溶液の1:40とL-Na+アスコルビンテの10mg/mLをCuSO4·5H2O溶液に加えてから、組織に適用します。 |
表1:免疫組織化学に利用される溶液
5. 免疫組織化学
- 基本的なフローティング プロトコル
注:ネスチンを染色する場合は、セクション 5.1 をスキップし、セクション 5.2 に進みます。基本的なフローティングプロトコルは、Tbr2またはダブルコルチン(DCX)専用で、チミジンアナログエドゥ染色なしです。- 不凍液からトリスバッファー生理生理生理(TBS)に48ウェルプレートで連続順にセクションを転送します。
- TBSトリトン(0.05%TBSトリトン、表1)で2回、ゆっくりと振りながら、またはロッカーに毎回溶液を吸引して5分間洗浄します。
- 透過性バッファー(0.5%TBS-トリトン、表1)を使用して断面を透過化し、低速で振りながら20~30分間使用します。
- TBSトリトンの10mLに0.33μLのロバ血清を加えてブロッキングバッファーを作ります。新鮮にして3日以内に使用してください。
- 透過性バッファーを吸引し、室温(RT)で30分から1時間のブロッキングバッファー内の断面をインキュベートする。
- ブロッキングバッファーで一次抗体溶液を作り、各ウェルに添加する。500 μL/ウェルは、すべての組織セクションが完全に水没するのに十分です。ロッカーまたはシェーカーでRTで一晩インキュベートします。
- 一次抗体の痕跡を除去するために、TBS-トリトン3xの吸引溶液およびすすり切り切りがそれぞれ10分間続きます。
- 蛍華素でインキュベートした一次抗体に対して二次抗体を一次抗体に対してインキュベートし、ロッカー上のRTで2時間のブロッキングバッファー溶液で調製した。
- TBSトリトンでそれぞれ5分間3xを洗浄し、次いで4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)溶液(1:100で300μM溶液)でセクションをインキュベートし、15分間PBSで希釈します。
- PBSのセクション3xを洗浄し、正に充電されたスライド上の前から後部へのシリアルオーダーを維持するセクションを取り付けます。水分が目に見えるまでRTでティッシュを乾燥させて、通常は約2−5分、取り付けメディアでカバーする前に乾かします。
- 抗原検索
注:このセクションは、ネスティンにのみ必要です。ネスティンを染色する場合は、チミジンアナログ染色の前にこのセクションを実行します(セクション5.3)。Edu で Tbr2 または DCX 染色をスキップします。- 組織セクションをPBSに配置し、前から後部へのシリアルオーダーを維持する正に充電されたスライドに5-8セクションを取り付けます。組織セクションをRTで乾燥させてスライドに完全に付着させ、約2−5分かかります。
- 容器にクエン酸バッファー(表1)を調(通常は1,000μLのピペットチップボックス)を用意します。
- 溶液が沸騰するまで5分間、電子レンジ(1,000W)でク硝酸バッファーを熱します。溶液が加熱されている間、取り付けられたセクションを20スライドガラススライドホルダーに置きます。5分後、ピペットボックスにセクションを持つスライドホルダーを慎重に配置します。
- 電子レンジの電力を50%に設定し、7分間調理する時間を7分間タイマーで始め、電子レンジを見ます。この7分間、溶液が沸騰し始めたら電子レンジを止め、沸騰が止まった後に電子レンジを続けます。
注:このステップの目標は、電子レンジの調理時間が終了していない場合でも、タイマーがなくなる後に停止し、7分間沸騰温度のすぐ下に水温を維持することです。より詳細な手順は、フサイニら20. - ク硝子バッファーとティッシュスライドで暖かい箱を取り出し、冷やすために氷のバケツに入れます。氷やその他の材料が溶液に入るのを防ぐためにカバーします。約30分待つか、溶液が冷たくなるまで触れる。
- チミジンアナログを使用する場合は、チミジンアナログ染色工程5.3.2に進みます。
- チミジンアナログ染色
注:エドゥとTbr2またはEduとDCXを染色する場合は、ここから始めます。- 組織セクションをPBSに配置し、前部から後部および同じ向きに連続した順序を維持する肯定的に帯電したスライドの上に5-8セクションを取付ける。スライドに完全に付着するように組織のセクションを乾燥させ、疎水性ペンまたはPAPペンを使用して境界線を描きます。
- 透過性バッファー(0.5%TBS-トリトン)を用いる断面を20~30分間透過化します。その後、TBSトリトンを使用してセクション2xをそれぞれ5分間洗浄します。
注:パーミアビライゼーションは、細胞内抗体の浸透を助けます。透過化時間は、組織の厚さと抗体効率に応じて調整することができます。あるいは、1つは透過性の効力を高めるために洗剤濃度を増加させることができる。しかし、組織の脆弱性は長時間の透過率で増加するため、透過的に過度に透過しないように注意する必要があります。 - 表1に従ってEdu反応溶液を調調す。Alexa488-azideの最終濃度は、Edu反応溶液の1mLで15μMです。
- エドゥ反応溶液の切片を30分~1時間インキュベートし、TBSトリトンで3倍をそれぞれ5分間洗浄する。このステップの後に光から保護するためにアルミニウム箔のカバースライド。この段階で、Edu反応が蛍光顕微鏡を用いて動作するかどうかを確認します。エドゥ標識細胞は、エピ蛍光顕微鏡下で蛍光を行います。
- 取付けられたティッシュセクションプロトコル
- ステップ5.3.4からスライドに取り付けられたブロック組織切片は、二次抗体と同じ動物で上げられたブロッキングバッファーを用いて、例えば、ロバ血清を、30分間〜1時間、次いでTBSトリトンで2xをそれぞれ5分間洗浄する。
- 1:200でブロッキングバッファー溶液中に一次抗体を混合することによりブロッキング工程中に一次抗体(すなわち、鶏の抗ネスチン)溶液を調製する。スライドあたり250 μLはティッシュが溶液中に完全に水没することを保障するのに十分である。
- 一次抗体溶液中の組織切片を、ブロック後にRTで一晩インキュベートする。使用する一次抗体に応じて、この手順を変更します。
注:抗体が高いバックグラウンドまたは非特異的結合を持つ場合、RTの代わりに4°Cでインキュベートすると、結果が改善される可能性があります。組織浸透が不十分な抗体は、必要に応じて2日間インキュベートし続けることができる。 - TBSトリトンで組織切片3xを5分間インキュベートし、過剰な一次抗体を除去する。次いで、フルオロフォア共役二次抗体(すなわち、1:200でAlexa 647アンチチキン)で組織切片をインキュベートし、RTで2時間のブロッキングバッファー溶液で調製する。
- TBSトリトンの組織切片3xを5分間インキュベートして、過剰な二次抗体を除去し、RTで15分間PBSで1:100で300 μM DAPI溶液を適用します。
- 余分なDAPIを除去し、綿棒または繊細なタスクワイプを使用して組織の周りからパップペンサークルを除去するために5分間PBSの組織セクション3xをインキュベートします。セクションを乾燥させてから、取り付けメディアとカバースリップを適用します。スライドをイメージングする前に、取り付けメディアを乾かします。
6. 画像収集
- 1 μmステップサイズで40倍の油倍光学レンズを用いた共焦点顕微鏡(材料表)を用いてDGの同じ側面をスライドラベルと画像で覆い、対照群からのブラインド実験群を1μmで、または20倍の2倍ズームを1μmで使用します。
注:40倍のオイル倍率は、解像度を向上しますが、20倍の2倍ズームよりも長い時間がかかります。 - 対物レンズを40倍に設定し、共焦点ソフトウェア(材料の表)の左上隅にある[探す]タブをクリックし、視野の中央に目的のDGセクションを設定します。
- DG を見つけて、左上隅の取得タブに切り替えて、次のチェック ボックスをオンにします: Zスタック、タイルスキャン、および位置。
- 600-750 ゲイン、1%−15%レーザー強度、1−10オフセットの間でチャンネル設定を設定します。いずれのチャンネルでも20%のレーザー強度を超えないようにしてください。ゲインと強度を設定する際に、ピクセルが過飽和にならないようにします。
注:これらの範囲は利用される装置の効率および染色の効率によって変わる。 - タイル スキャン ウィンドウでタイルを水平方向に 7 水平に 3 に設定し、現在使用されている設定と同じ設定を使用してスキャン概要イメージを押します。たとえば、水平方向の 7 x 3 の垂直方向と 20 倍のズームで 20 倍の目標を使用します。
- 概要スキャン後、DG が期待されるイメージ内に完全に収入っていることを確認します。そうでない場合は、DG のビューが完全に概要イメージに表示されるまで調整します。
- ファインフォーカスノブを使用して異なるZスタックをスクロールして、イメージングの深さを設定します。DG 全体が始点と終点内にあることを確認します。ステップ サイズが 1 μm であると仮定すると、各画像は約 40 ステップである必要があります。
- 双方向スキャンでスキャン速度を 9 に設定し、集録モード ウィンドウで平均化を行いません。次に、位置ウィンドウに位置を追加します。
注:手順 6.3−6.8 を繰り返し、複数の DG を一度にイメージします。スキャン速度を上げると画質は低下しますが、全体的な撮影時間は短縮されます。画質が低すぎる場合は、スキャン速度を下げるか、平均を上げます。 - 準備ができたら、[実験の開始]ボタンをクリックします。前軸から後軸に沿って、マウスあたりの DG の 5 つのセクションをスキャンします。たとえば、左側の DG がセクション 1 のイメージ化されている場合は、セクション 2 の次の最後左側の DG をイメージします。
- 共焦点ソフトウェアのプロセスタブの下にあるステッチ機能を使用して、歯状のジャイルの完全なイメージを形成するために、別々の画像をステッチします。または、FIJI (ImageJ) を使用して画像をステッチし、完全な歯状のジャイルを形成します。
- 定量化のためにステッチされた画像を保存します。
7. 画像解析
- 最大投影として FIJI を使用し、異なる色でマージされたチャネルを持つ合成画像として、コローカライズを簡単に視覚化するために、FIJI を使用して各歯状ジャイルス セクションの各画像を開きます。
- ポリゴン選択ツール(左から3番目のボックス)を使用して、最大投影画像の各セクションのDGの面積を測定し、各マウスの各セクションの記録を作成します。これは、密度の計算に使用される DG の面積になります。
- プラグインの下で見つかったFIJIプラグイン細胞カウンターを使用して、一次抗体(すなわち、ネスチン)とチミジンアナログEduをコローカライズした複合画像からDG内の細胞数を記録する|分析 | セルカウンター | セルカウンター.さらに、放射状のプロセスで Edu 陽性およびネスティン陽性細胞の合計数を記録します。
注:ネスティンの場合、形態に注意を払う必要があります。神経幹細胞を定量化する場合は、放射状プロセスを持つ細胞のみが定量されていることを確認してください。歯状のジャイルス断面を定量化する場合は、特に焦点面の外側のセルを視覚化する場合に、すべてに同じ基準を適用します。セルがフォーカル プレーン内にない場合は、セルをカウントしないでください。立体定量の詳細については、West et al.21を参照してください。 - 後で分析するためにすべてのデータをコンパイルするには、スプレッドシート ソフトウェアにセル数を入力します。
- 各セクションのコローカライズされた細胞の密度を、各動物の各セクションの合計体積で割ることによって計算します。たとえば、1 つの動物のネスチン+/edu+ 細胞の合計を 1 つの動物の DG 容積の合計で割ることにより、幹細胞密度を得ます。各ステップが 1 μm であると仮定して、領域に Z ステップの合計増分を乗じて、各セクションの体積を計算します。
注:このプロトコルでは、組織が40 μmで切断されているので、合計ステップは40に近い必要があります。 - 対処しようとしている質問に対して、追加の必要な計算を実行します。この例では、横逆苔細胞を刺激した後の増殖細胞の総数、総幹細胞集団、増殖幹細胞の割合を計算します。
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Representative Results
上述の実験手順(図1A,B)に続いて、海馬内の神経原性ニッチに対する反対方式の苔細胞突起を刺激する効果を決定することができた。5-HT2Aクレラインを標識するコッシー細胞と組み合わせたクレ属Gq結合刺激DREADDウイルスを利用することにより、コセ細胞からの興奮性突起を反対方DG上に選択的に活性化し、強い苔状細胞を決定した。刺激は幹細胞の静止を促進した(図1C)。組織の分析前に正確なウイルス送達を確認した(図2A,B)。また、c-fos免疫組織化学実験を用いて苔状細胞の活性化を確認した(データは示さない)。不適切なウイルス注射の場合は、さらなる分析から動物を除外する。不適切な注入とは、目的の座標をターゲットにしなかったり、目的の領域外の発現のほとんどを持っていたり、ウイルスの送達をほとんど持たないものである。この実験では、DGのヒルス中の苔状細胞が目的の標的であり、注射がhilusの外側にある場合は除外された。セクション5.2および5.3で概説したネスチン染色に対してチミジンアナログ、Edu、および抗原検索を用いることで、増殖神経幹細胞の標識に成功することができました(図3A)。さらに、抗原検索工程、セクション5.2を省略することにより、Tbr2陽性神経前駆体および神経芽細胞、およびDCX陽性神経芽細胞および未熟ニューロンに標識することができた(図3A)。密度を計算し、スライド上に取り付けられた組織の例を提供するために定量化され、使用される領域の例を示す(図3Bおよび図4A)。さらに、実験アプローチの参考として、成功した実験とサブパー実験の両方が提供される(図4B)。最後に、成功した実験から得ることができるいくつかの異なる定量があります (図 5A-D)15.定量には、増殖する神経幹細胞の密度(ネスチン+/Edu+/体積)、増殖神経幹細胞(ネスチン+/Edu+/totalネスティン)、全増殖細胞(Edu+/体積)、全幹細胞プール(ネスチン+/体積)が含まれます。).苔状細胞の逆発刺激では、神経幹細胞増殖の減少が認められた。適切な抗体を用いて神経前駆体および未熟ニューロンに対して同様の定量を得ることができる。
図1:成体神経幹細胞の回路調節をアッセイする実験的アプローチ(A) プロトコルで概説されているさまざまな手順を表す回路図。(B) げっ歯類の苔状細胞を刺激するために用いられる実験的アプローチのタイムライン。(C) 刺激のための反対の苔細胞を標的とする注射回路図。(D) 成人神経幹細胞の発達系統の概略図を、粒状帯(SGZ)、顆粒細胞層(GCL)、および分子層(ML)と異なる発達段階で使用される対応する抗体を有する。異なる発達段階には、静止または活性化されたラジアル神経幹細胞(NSC)、神経前駆体(NP)、神経芽細胞(NB)、未熟顆粒細胞(GC)、および成熟性GCのいずれかが含まれる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:効果的なウイルス送達の実証(A) 正確なウイルス送達の免疫蛍光画像。ウイルス粒子は、ヒルス(白箱領域)の苔状細胞を標的とするmCherry蛍光標識を発現する。DAPIは細胞核を標識する。正確なウイルス送達のイメージ側は、反対側注入側からの明確な苔状繊維突起を示す。(B) オフターゲットウイルス注射の免疫蛍光画像。この場合、画像側には逆側の苔状繊維が存在しないことに注意してください。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:増殖神経幹細胞と子孫の解析(A) 特定の細胞段階マーカーネスティン(神経幹細胞および前駆体)、Tbr2(神経幹細胞、神経前駆体)、およびDCX(神経芽細胞、未熟ニューロン)と共局所化するチミジンアナログエドゥの免疫組織化学画像白い矢印。スケールバー = 10 μm. (B) 密度の計算に使用される歯状のジャイル内の領域の代表的な測定。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:免疫蛍光製剤のデモンストレーション。(A) 前軸から後軸への取り付けられた組織切片の立体的分離を示す概略図。赤いボックスは、イメージされた側面を示します。(B) 神経系統マーカーに対する成功したサブパー免疫蛍光実験の実証スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:苔状細胞の逆発活性化は、神経幹細胞増殖を減少させる。(A) 歯状ジャイル中のネスチン+/Edu+細胞の免疫組織化学定量は、反対方の苔状細胞の刺激後の増殖の減少を示す。(B) 活性化された逆モッシー細胞を有する群における増殖神経幹細胞の割合の減少。(C) いずれの群においても神経幹細胞密度に有意な変化はなかった。(D) 歯状のジル中の増殖細胞の全体的なレベルに変化はなかった。値は測定の平均±標準誤差を表します。p < 0.05 (制御の場合は n = 3、hM3D グループの場合は n = 5)。この図はYeh et al.15から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの目的は、特定の神経回路を操作すると、一連の免疫組織化学技術を使用して生体内の成体海馬神経新生を調節する方法を評価することです。特定の神経回路によって媒介される成人神経新生のアッセイ活性依存調節は、多様な神経回路を研究するための修飾のための大きな可能性を有する貴重な技術である。これらのタイプの実験の成功は、正確なウイルス送達、所望の操作のための適切なウイルス選択、チミジンアナログの適切な送達、動物の年齢、免疫染色効率、成功を含む複数の要因に依存します。トランスカルダイヤル灌流、および画像の公平な定量化。例えば、不正確なウイルス送達は、問題の回路とは無関係の表現型をもたらすターゲット効果をオフに引き起こす可能性があります。さらに、低品質の免疫蛍光技術は、現在の細胞の真の数を隠し、したがって生物学的に関連しない表現型を産生しうる。制御するもう一つの非常に重要な要因は、成人神経新生が年齢依存性22であることを考慮して、実験を行う際のマウスの年齢である。最後に、各セクションが公平に採点されることが重要です。バイアスを減らすために、体系的なアプローチを取り、人が形態学的情報を使用して成人NSC開発の段階を識別するのに熟練していることを確認します。さらに、コントロールと治療の両方のグループを盲目にし、画像定量後にそのアイデンティティを明らかにする。バイアスを減らすための追加の手段として、2 つの別々の個人が同じデータセットを定量化して、観察された結果を検証できます。
成人NSCおよび新生児子孫の回路活性依存調節を研究するために、このアプローチに関連するいくつかの制限があります。1 つ目の制限は、この方法では、NsC が問題の回線を操作することから全体的な影響を仲介する回路内の特定のセルタイプに関する情報を提供しないことです。これは、成人NSCに対して意味的な効果があるかもしれないが、その効果が1つまたは複数の中間細胞タイプを介して作用する可能性があることを意味する。この懸念に対処する効率的な方法は、これらの研究を電気生理学と組み合わせて仲介者を固定することです。このプロトコルのさらなる制限は、特定のCreマウス(5-HTR2A)ラインまたは目的の回路を標的とすることができるウイルス構造(AAV5-camKII-hM3d-mcherry)のいずれかを持つ必要があることです。有効な細胞特異的なCreマウスラインが目的の問題に容易に利用できない場合、この回路を研究する能力はますます困難になる。しかし、脳内の多くの細胞型は、Cre固有のマウスラインを持っています。このプロトコルのより小さい制限は、効果的な不活性リガンドとしてCNOに関連しています。最近の研究は、DREADDsを活性化するために使用される不活性化学物質であるCNOがクロザピンに代謝し、行動現象23を引き起こす可能性があることを実証した。ただし、効率的な対処方法は、各実験に適切なコントロールを含める方法です。適切な制御の例としては、CNO コントロールと DREADD コントロールの両方が含まれ、そこで CNO がコントロール レポーター ウイルス (AAV5-DIO-mCherry) と組み合わせて管理され、CNO がレポーター ウイルス グループに管理されていない生理生理情報のみのコントロールが含まれます。これらのコントロールを含めると、CNO のみの影響を分離できます。あるいは、C21として知られる二次不活性リガンドは、最近、実証された行動効果を有しない同様の有効性および効力を有することが実証されている24である。最後に、このプロトコルの最終的な制限は、各動物が実験中に消費するCNOの量を制御することです。異なる動物は、様々な程度でCNO含有水を飲むので、成人の神経新生に影響の範囲を持つことができます。一般に、マウスは24時間で約4mLのCNO水を飲む傾向がある。これは、1 mg/200 mL動物の濃度で、1日あたりのCNOの合計0.02 mgを受け取ることを意味し、これは、食後内に注入された単一のCNO用量の量に匹敵する。CNOのタイムリーな結合投与が懸念される場合、米腔内注射への切り替えがより良い代替手段である可能性がある。
このプロトコルを使用する利点は、成人神経新生を調節する際に達成される特異性の程度である。過去の神経新生研究は、回路成分を調節するために全身的に投与された薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストを利用している。これらの非特異的な操作は、意味の違いを生み出すが、成人の神経幹細胞調節に関与するメカニズムに関する洞察をほとんど提供しない。さらに、このプロトコルは、成人の神経新生に対する様々な回路ワイド効果を調べるために容易に改変することができる。例えば、阻害性DREADDに切り替えたり、一度に1つまたは複数の脳領域を標的にすることによって、成人神経新生の回路特異的な調節を理解するための質問の配列を尋ねることができます。以前のアプローチに比べてこのプロトコルを使用するもう一つの利点は、ネスチン抗体を使用すると、ネスチン:GFPなどの蛍光的にコードされた神経幹細胞レポーターのトランスジェニック動物の繁殖を排除し、効率を高め、1回あたりの時間を短縮することです。実験8.さらに、この技術は、CNOを投与する際のげっ歯類の取り扱いを制限し、実験中のげっ歯類のストレスを軽減します。ストレスに敏感なプロセスを研究する際にストレスを軽減することが重要です。最後に、このアプローチは、例えば、NSCを調節する反対の苔細胞回路が空間学習またはストレスレジリエンスの役割を果たしているかどうかを尋ねることに興味がある場合など、行動アッセイを含むように簡単に修正可能です。
このアプローチを使用する場合の主な技術的な難しさは、正確なウイルス配信です。熟練したげっ歯類の外科医になると、練習が必要であり、重要なトラブルシューティングが必要です。したがって、ウイルス力付き、標識効率、およびウイルス拡散をテストするための一連のパイロット実験を行うことをお勧めします。我々は、特定の血清型が異なる広がりパターンを持っており、AAV2血清型がAAV5またはAAV8より少ない広がりを見出した。さらに、これらの実験のそれぞれに信頼できるウイルス包装プロバイダを持つことをお考えめします。パイロット手術を行うことで、これらの懸念の多くに対処することができ、1つは時間を節約することができます。また、1つのテスト異なるCNO濃度をテストして、目的の回路を刺激または阻害することをお勧めします。一般に、1 mg/kg はテスト済み回路を十分に活性化しますが、特定のセルタイプは多かれ少なかれCNOを必要とする場合があります。CNO投与の用量は、モッシーセル15のようなものを見たときに特に特定の回路に影響を与えることができることに注意することが重要です。
このプロトコルの代替アプリケーションには、同時行動テスト、代替回路の変調、および神経新生特徴の追加分析が含まれます。動作テストを実行するには、説明されているプロトコルに従って、CNO を管理した後、新しい位置アッセイや空間ナビゲーション タスクなどの特定の動作タスクを実行できます。このアプローチの利点は、単一の実験で、回路固有の行動表現型につながる可能性のある動作と回路固有の情報の両方が得られます。代替回路を調節するために、1つは異なるCreラインとウイルスベクトルの組み合わせを使用することができます。例えば、心室のテグメンタル領域(VTA)またはVTAからドーパミン作動性ニューロンを阻害する方法を理解することに興味がある場合、1つはチロシンヒドロキシラーゼクレマウスラインを使用し、Cre依存性hM4D(阻害性)を注入することができます。成人神経新生のドーパミン作動特異的調節を決定するためにVTAにDREADDウイルス。このアプローチを使用して代替脳領域を標的にする可能性は広大であり、戦略的に説得力のある神経回路を尋問するために使用することができます。最後に、このアプローチは、成人神経新生の追加段階を調査することを可能にする。例えば、刺激的な苔細胞が未熟ニューロンの樹木化または樹状長さに与える影響を理解したい場合、1つは同様のプロトコルに従うが、ショル分析などの代替分析を行う。
要約すると、このプロトコルは、DREADD技術を介して成人NSCおよび神経新生の回路活性依存調節をアッセイするための詳細なステップバイステッププロセスを提供する。このプロトコルの強みは、回路特異的な成人神経幹細胞調節に関する広範な質問に対処するために容易に変更される能力にあります。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリドロミックリピート(CRISPR)技術の進歩により、細胞特異的なCreマウスラインを生成して、高度なウイルス構造と組み合わせて、ますます複雑化する質問に対処できるようになりました。このプロトコルの適用性を拡大します。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
L.J.Q.は、ダイバーシティサプリメントR01MH111773の下で国立衛生研究所の精神保健研究所によってサポートされただけでなく、T32トレーニング助成金T32NS007431-20。このプロジェクトは、NIH(MH111773、AG058160、NS104530)からJ.S.に授与された助成金から支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
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