Summary
Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.
Abstract
Questioni bioetiche relazionati alla manipolazione delle cellule staminali embrionali hanno ostacolato i progressi nel campo della ricerca medica. Per questo motivo, è molto importante ottenere cellule staminali adulte da diversi tessuti quali adiposo, cordone ombelicale, midollo osseo e del sangue. Tra le possibili fonti, polpa dentale è particolarmente interessante perché è facile da ottenere per quanto riguarda considerazioni bioetiche. Infatti, le cellule staminali dentarie polpa umana (hDPSCs) sono un tipo di cellule staminali adulte in grado di differenziare in cellule di un neurone-come e può essere ottenuta dal terzo molare di pazienti sani (età 13-19). In particolare, la polpa dentale è stato rimosso con un escavatore, tagliata a fette piccole, trattata con collagenasi IV e coltivata in un matraccio da. Per indurre il differenziamento neuronale, hDPSCs sono stati stimolati con EGF/bFGF per 2 settimane. Precedentemente, abbiamo dimostrato che durante il processo di differenziazione il contenuto cellulare prion proteina (PrPC) in hDPSCs aumentato. L'analisi citofluorimetrica ha mostrato un'espressione precoce di PrPC che aumentato dopo il processo di differenziamento neuronale. Ablazione di PrPC di siRNA PrP ha impedito il differenziamento neuronale indotta da EGF/bFGF. In questa carta, illustriamo come abbiamo migliorato l'isolamento, separazione e metodi di coltivazione in vitro di hDPSCs con diverse procedure di facile, più efficienti cloni a cellula sono stato ottenuto e su larga scala l'espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) è stato osservato. Indichiamo anche come hDPSCs, ottenuti con metodi dettagliati nel protocollo, sono un eccellente modello sperimentale per studiare il processo di differenziamento di cellule staminali mesenchimali e successivi processi cellulari e molecolari.
Introduction
Cellule staminali mesenchimali sono state isolate da diversi tessuti, compreso il midollo osseo, sangue del cordone ombelicale, polpa dentaria umana, tessuto adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. come riportato da diversi autori, hDPSCs Visualizza plastica aderenza, una tipica morfologia di fibroblasto-come. Questi rappresentano una popolazione altamente eterogenea con cloni distinti e le differenze nella capacità proliferativa e differenziante7,8. hDPSCs express markers specifici per le cellule staminali mesenchimali (cioè CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), esse sono negativi per alcuni marcatori ematopoietici (quali CD14 e CD19) e sono capaci di differenziazione in vitro di multilineage9, 10,11.
Diversi autori hanno dimostrato che queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del neurone-come utilizzando protocolli diversi, che includono l'aggiunta di NGF, bFGF, EGF in combinazione con la specifica media e integratori7,12. Inoltre, molte proteine sono coinvolti durante il processo di differenziamento neuronale e, tra queste, parecchie carte mostrano un ruolo rilevante e significativa espressione della proteina prionica cellulare PrP (C), sia in cellule staminali embrionali ed adulte13, 14. PrPC rappresenta una molecola pleiotropica capace di svolgere diverse funzioni all'interno delle cellule come metabolismo del rame, apoptosi, e resistenza a ossidativo stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Nel nostro precedente carta23, abbiamo studiato il ruolo della PrPC nel processo di differenziazione di un neurone di hDPSCs. Infatti, hDPSCs express precocemente PrPC e, dopo il differenziamento neuronale, è stato possibile osservare un aumento supplementare. Altri autori hanno supposto un ruolo possibile di PrPC nei processi di differenziamento delle cellule staminali. Infatti, PrPC spinge la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in neuroni, oligodendrociti e astrociti24. Lo scopo di questo studio era quello di sottolineare la metodologia per ottenere cellule staminali da polpa dentaria, il processo di differenziazione e il ruolo di PrPC durante il differenziamento neuronale.
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Protocol
Terzi molari utilizzati nello studio sono stati asportati dai pazienti (13-19 anni) con senza precedenti di droga o alcol, tutte per non fumatori e con una adeguata igiene orale. Il giorno della spiegazione, presso il dipartimento di scienza odontoiatria e maxillo-facciale dell'Università "Sapienza" di Roma, il consenso informato è stato ottenuto da pazienti o i genitori. Il consenso informato è stato ottenuto basato su considerazioni etiche e approvazione del comitato etico.
1. dente ed estrazione della polpa dentale
-
Preparazione del mezzo appropriato per la conservazione o il trasporto.
- Preparare medio bassa concentrazione per volta dell'Aquila di Dulbecco di glucosio (DMEM-L) con L-Glutammina (494,5 mL).
- Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%) e 0,5 mL di amfotericina (0,1%).
- Estrarre il terzo molare dal paziente, rapidamente sciacquare con PBS, messo in una provetta da 15 mL con il mezzo e trasferirlo al laboratorio in meno di 2 ore.
- Sotto una cappa biohazard, aprire il dente con una fresa di passata di taglio coronale parallelo e tangente attraverso il tetto della camera pulpare.
- Rimuovere la polpa con un piccolo escavatore delicatamente e metterlo in una provetta.
- Lavare le tre volte con PBS e centrifugare a 2.500 x g per 10 minuti a TA.
2. trattamento della polpa dentale e rilascio di cellule staminali
- Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in soluzione di Hank e metterlo in una capsula di Petri. Incubare per 2 ore a 37 ° C in 5% CO2.
-
Digitare preparazione soluzione della collagenosi di IV.
- Preparare 0,8 mL di DMEM-L.
- Sciogliere 1 mg di collagenosi di IV tipo in 0,8 mL di DMEM-L e vortexare per diversi minuti.
- Aggiungere DMEM-L fino a 1 mL per avere una concentrazione finale di 1 mg/mL.
- Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 µM.
- Rimuovere la soluzione di Hank mediante centrifugazione a 2.500 x g per 10 min a RT e dividere la polpa in fettine di circa 1 mm ciascuno con un bisturi monouso.
- Mettere le fettine di polpa in una capsula di Petri e incubare con 1 mL di collagenasi di tipo IV per 15 min a 37 ° C in 5% CO2.
-
Preparazione di coltura media (500 mL).
- A 445 mL di DMEM-L con L-glutammina.
- Aggiungere 50 mL di siero bovino fetale (FBS) (10%).
- Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%).
- Centrifugare il campione a 2.500 x g per 10 min a RT, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in mezzo (punto 2.5) e cultura nella beuta T25 specifico di cellule staminali a 37 ° C in 5% CO2.
3. propagazione e coltura della cellula formativa di
- Ogni giorno controllare la cultura e, dopo 3 giorni di crescita, osservare diversi cloni di cellule aderenti all'interno della beuta.
- Ogni 3 giorni cambiare il terreno di coltura.
- Tra 7 e 12 giorni, una volta che le celle aderenti hanno portata confluenza, staccarli trattando le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente utilizzando un raschietto di cella.
- Aggiungere 4 ml (rapporto 1:5) nel terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 6 min a 259 x g, rimuovere il supernatante e inserire le celle in una boccetta di T25 di propagare.
Nota: Ogni 3 giorni le cellule raggiungono la confluenza. - Propagare le cellule fino a 21 o 28 giorni (circa 6-8 passaggi) per evitare la presenza di non-staminali come le cellule nella cultura.
- Staccare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o raschiare delicatamente. Centrifugare la sospensione cellulare per 6 min a 259 x g.
- Rimuovere il supernatante e testare le cellule per analisi citofluorimetrica (passaggio 6).
4. transitoria PrPC tacitazione di siRNA
- Coltura del hDPSCsin 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5) per 24 h.
-
Il giorno dopo, preparare siRNA PrP medie (400 µ l).
- In una provetta sterile, µ l 384 DMEM-L.
- Aggiungere 1 µ l per ogni tipo di siRNA PrP in DMEM-L per avere una concentrazione finale di 5 nM (4 siRNA PrP sono stati utilizzati e verificati dal fornitore per garantire un atterramento efficienza ≥ 70%).
- Aggiungere 12 µ l di transfectionreagent in DMEM-L.
- Vortice la miscela e incubare per 10 min a RT per consentire la formazione di complessi di transfezione.
- Aggiungere 400 μL di siRNA PrP medio per ogni campione e incubare per 6 h a 37 ° C.
- Senza scartare siRNA PrP medio, aggiungere 1,6 mL (rapporto di 1 a 5) di terreno di coltura (punto 2.5).
- Lasciare le cellule per 72 h a 37 ° C.
- Eliminare il surnatante e lavare 3 volte con 2 mL di PBS a TA.
- Aggiungere 2 mL di terreno di coltura neuronale per 7 o 14 giorni (punto 5.1).
- Cambiare il terreno di coltura neuronale ogni 3 giorni.
Nota: Sostituire il siRNA PrP soluzione sostituire ogni volta il terreno di coltura neuronale. - Alla fine del tempo, lavare 3 volte con 2 mL di PBS a RT e test per gli antigeni di superficie neuronali mediante analisi Western Blot.
5. un neurone processo di induzione di hDPSCs
-
Preparazione del terreno di coltura neuronale (500 mL).
- Preparare 444,7 mL di media basale formulato di cellule neuronali.
- Sul supporto di aggiungere 50 mL di supplemento privo di siero utilizzato per sostenere la redditività a lungo termine delle cellule staminali embrionali ed adulte neuronale (10%).
- Aggiungere 200 µ l di basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (concentrazione finale 40 ng/mL) e 100 µ l di fattore di crescita epidermico (EGF) al mezzo (concentrazione finale 20 ng/mL).
- Aggiungere 5 mL di penicillina/streptomicina (1%) al mezzo.
- Cultura hDPSCs in piastre da 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) fino a 28 giorni dalla separazione della polpa e stimolarli con 2 mL di terreno di coltura neuronale.
- Ogni 3 giorni scartare il surnatante, lavare 3 volte con 2 mL di PBS a RT e sostituire 2 mL di terreno di coltura neuronale.
- Dopo 7 o 14 giorni, staccare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente con un raschietto.
- Aggiungere 4 mL (rapporto 1:5) del terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina.
- Verificare la presenza di antigeni di superficie neuronali (passaggio 6) o l'espressione della proteina prionica (passaggio 7) analisi di citometria a flusso.
6. caratterizzazione di hDPSCs tramite flusso Cytometry
- Selezionare stromali mesenchimali (MSC)-neuronali o specifici antigeni di superficie.
- Cultura hDPSCs in piastre da 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5).
- Staccare hDPSCs a 28 giorni dalla separazione della polpa dentale o dopo 14 giorni di un neurone di coltura (passaggio 5.1) con 1 mL di tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C o delicatamente un raschietto.
- aggiungere 4 ml (rapporto 1:5) del terreno di coltura (punto 2.5) per interrompere l'azione della tripsina e centrifugato a 259 x g per 6 minuti a TA. altro lavare 2 volte con 2 mL di PBS a TA.
- Difficoltà il hDPSCs non trattata o trattata con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 min a 4 ° C.
- Permeabilize hDPSCS con tensioattivi non ionici 0.1% (v/v) in PBS per altri 10 min a TA.
- Eseguire il blocco con 5% latte scremato in polvere in 1 mL di PBS per 1 h a TA.
- Lavare 3 volte con 1 mL di PBS e incubare le cellule con anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 cellule), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 cellule) e anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 cellule) mAb per 1 h a TA.
- Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di PBS e incubare con PE anti-topo (01:50 / 5 x 105 cellule) o anti-coniglio CY5 mAb (01:50 / 5 x 105 celle) per ulteriore 1 h a TA.
- Utilizzare gli anticorpi secondari per gating le cellule immunopositive (anti-topo PE o anti-coniglio CY5 mAb) e analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso e acquisire almeno 20.000 eventi.
7. valutazione dell'espressione di PrPC in hDPSCs di analisi di citometria a flusso
- Cultura la hDPSCsin 6 pozzetti (2 x 105 cellule/mL) con 2 mL di terreno di coltura (punto 2.5).
- Staccare hDPSCs alle 21 e 28 giorni dalla separazione della polpa dentale e dopo 7 o 14 giorni con terreno di coltura neuronale (azione 5.1) con 1 mL di tripsina-EDTA e fermare l'azione di tripsina, come descritto al punto 6.4. Difficoltà gli esemplari con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 min a 4 ° C.
- Permeabilize con 0.1% (v/v) non ionici surfactantin PBS per 10 min a RT. rimuovere il surnatante e macchia le celle con coniglio anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 celle) mAb per 1h a RT. Incubare con anti-coniglio CY5 (01:50 / 5 x 105 celle) mAb per ulteriore 1 h a TA.
- Analizzare tutti i campioni con un citometro a flusso e acquisire almeno 20.000 eventi.
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Representative Results
Le procedure di isolamento e la separazione di hDPSCs da polpa dentaria, ottenuta dal terzo molare, sono processi complessi, in cui piccoli cambiamenti possono portare un risultato rovinoso. In questa carta, utilizziamo il protocollo di Arthur et al.. 12 con molti nuovi miglioramenti. Uno schema rappresentativo delle procedure è illustrato nella Figura 1.
hDPSCs rappresenta una popolazione eterogenea di cellule con cloni distinti e differenze nelle capacità proliferativa e differenziante7,8. Dopo la separazione della polpa e semina di minuscoli frammenti di polpa, abbiamo osservato i mazzi delle cellule in espansione sulla periferia. La figura 2 Mostra un piccolo agglomerato di cellule a 1 giorno (pannello sinistro), 4 (pannello centrale) e 7 giorni (pannello di destra) dalla separazione della polpa dentale. Generalmente, questi mazzi delle cellule di crescono fino a raggiungere la confluenza approssimativamente tra 7 e 12 giorni.
Queste cellule, dopo differenziamento neuronale indotta da EGF/bFGF, riducono la loro crescita e, dopo due settimane è stato possibile osservare cambiamenti significativi nella conseguenza di morfologia e i neurites di cella (Figura 3).
In Figura 4, indichiamo che non trattati hDPSCs express multipotenti mesenchimali stromali specifici antigeni di superficie quali CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-15,9. In caso contrario, dopo stimoli appropriati induzione neuronale, hDPSCs esprimono marcatori neuronali specifici quali β3-tubulina, NFH e GAP43. hDPSCs, stimoli non trattata o trattata con induzione di un neurone, non esprimono marcatori ematopoietici quali CD14 e CD19.
In Figura 5, indichiamo che hDPSCs precocemente esprimono PrPC (21 e 28 giorni) e, dopo il processo di differenziamento neuronale indotto da EGF/bFGF per ulteriori 7 e 14 giorni, il PrPC contenuto aumentato (Figura 5A). Dal momento che diversi autori hanno segnalato che PrPC è coinvolta nella differenziazione cellulare neuronale, abbiamo valutato il ruolo di endogeno PrPC in questo processo. Di conseguenza, un piccolo RNA interferente (siRNA PrP) è stato applicato per l'ablazione PrPC e la sua funzione. Il pretrattamento con siRNA per 72 h prima di EGF/bFGF stimoli per 14 giorni impedisce che l'espressione di marcatori neuronali B3-tubulina e NHF (Figura 5B). I dati mostrano che il silenziamento di PrPC di siRNA influenzato il processo di differenziazione di un neurone di hDPSCs, indotta da EGF/bFGF dopo 2 settimane.
Figura 1 : Schema di separazione della polpa dentale dal terzo molare. Il dente è stato aperto con una fresa da passata di taglio coronale parallelo e tangente attraverso il tetto della camera pulpare e la polpa è stato delicatamente rimosso in condizioni sterili con un piccolo escavatore e collocata in una provetta. La polpa, dopo il trattamento della soluzione di hank, è stata tagliata a fette e trattata con collagenasi IV per 15 min e propagata in una boccetta di T25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : hDPSCs morfologia a diversi giorni dalla separazione della polpa dentale mediante microscopio a contrasto di fase. Morfologia dei hDPSCs da polpa dentaria in giorni diversi (1, 4, 7) dalla separazione della polpa dentale. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Neuriti di hDPSCs di microscopio a contrasto di fase. Morfologia del hDPSCs da dental pulp non trattata o trattata con EGF/bFGF per 14 giorni. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : caratterizzazione hDPSCs. Analisi di citometria a flusso di CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-tubulina, espressione di NFH e GAP43 in hDPSCs non trattata o trattata con EGF/bFGF per 14 giorni. Numero di cellulare di istogrammi rappresentano log fluorescenza vs , gated sulla popolazione delle cellule di una dispersione di dispersione/avanti lato istogramma (SS/FS). Ogni pannello è stato confrontato con i corrispondenti anticorpi secondari come controllo negativo. Un esperimento rappresentativo tra 3 è mostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Ruolo della PrPC durante il differenziamento neuronale di hDSPCs. (A) analisi citofluorimetrica dell'espressione di PrPC non trattata (21 e 28 giorni dalla separazione della polpa dentale) e dopo ulteriori 7 e 14 giorni con media induzione neuronale EGF/bFGF. Ogni pannello è stato confrontato con il relativo regolatore negativo dell'isotipo IgG. Un esperimento rappresentativo tra 3 è mostrato. (B) analisi di Western blot di marcatori neuronali β3-tubulina ed espressione di NFH (28 giorni dalla separazione della polpa dentale) e dopo ulteriori 14 giorni con media di induzione neuronale EGF/bFGF in presenza o assenza di siRNA PrP. Questa figura 5 (A, B) è stata modificata da "Ruolo del Prion proteina-EGFR complesso multimolecolare durante il differenziamento neuronale della polpa dentale umane cellule staminali" 23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo lavoro, ci siamo concentrati sulla metodologia per l'isolamento e la differenziazione di un neurone di hDPSCs; Inoltre, abbiamo valutato il ruolo di PrPC in questo processo. Esistono diversi metodi per isolare e differenziare hDPSCs nel neurone-come le cellule e passaggi critici durante il processo. hDPSCs sono in grado di differenziare in diversi lignaggi quali condroblasti, adipociti, osteoblasti e neuroni. Nella nostra carta, abbiamo studiato i meccanismi di differenziamento neuronale e la presenza di PrPC. Come discusso in precedenza, queste cellule esprimono tipici mesenchimali stromali specifici antigeni di superficie quali CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-110,25,26.
Nel protocollo, diversi passaggi critici possono causare il fallimento della procedura di separazione. Il primo passaggio fondamentale è rappresentato dalla scelta di pazienti27. Nella nostra esperienza, abbiamo trovato che l'età aumentante dei donatori (> 20) riduce gradualmente la capacità di proliferazione e differenziazione delle cellule staminali. Nei nostri esperimenti, abbiamo usato i terzi molari asportati da pazienti di età 13-19 anni, con senza precedenti di droga o alcol, tutte per non fumatori e con adeguata igiene orale.
Il secondo passaggio critico è rappresentato dalla scelta dell'enzima per separare le cellule dal tessuto della polpa, che potrebbe rappresentare il passaggio caldo principale della procedura di separazione di cellule staminali. In realtà, ci siamo resi conto che un ampio uso di collagenasi I e II, gli enzimi che possono essere troppo aggressivi, poteva danneggiare le cellule presenti nel tessuto della polpa durante il processo di separazione. Per questo motivo, abbiamo deciso di utilizzare collagenasi IV perché questo tipo di collagenasi come attività più bassa trittico che collagenasi di tipo I e II. Seguendo esattamente la procedura, è possibile ottenere cellule staminali nel 90% dei denti trattati.
Dopo la separazione, la soluzione contenente hDPSCs è coltivata in boccette appropriati fino al passaggio 6° (circa 21-28 giorni) per evitare la presenza di cellule staminali nella cultura. 28 giorni, erano testati per la presenza di antigeni tipici mesenchymal (come sopracitato) e utilizzati per esperimenti solo quando erano positive. Infatti, nonostante i progressi compiuti nel corso di anni su hDPSCs, ci sono ancora importanti limitazioni rappresentata dall'estrema eterogeneità della popolazione.
Come dimostrato da diversi autori, ci sono tipi differenti delle cellule della popolazione nella polpa dentale e, ad oggi, ha sconosciuto che cosa è i fenotipi migliori in grado di differenziarsi in ogni stirpe mesenchymal (condroblasti, adipoblasts, osteoblasti o neuroni). Per evitare gli attuali limiti della nostra e di altre procedure, il prossimo passo sarà di selezionare delle popolazioni cellulari con fenotipi specifici utilizzando anticorpi monoclonali specifici.
Nel precedente lavoro, abbiamo mostrato che PrPC è espresso da hDPSCs. Infatti, è possibile osservare una debole positività alle 21 giorni e un aumento del contenuto di PrPC ai 28 giorni. Inoltre, abbiamo osservato che durante l'induzione neuronale mediata da EGF e bFGF, PrPC contenuto è stato ulteriormente aumentato. Inoltre, abbiamo studiato il ruolo di endogeno PrPC nel processo di induzione di un neurone di hDPSCs. Il silenziamento transitoria di PrPC ha impedito il processo di differenziazione di hDPSCs indotta da EGF/bFGF23.
Abbiamo perfezionato e migliorato i metodi di isolamento, la separazione e la coltura in vitro di hDPSCs con procedure semplici e versatili. Queste innovazioni permettono di ottenere cloni di cellule più efficienti e l'espansione su larga scala delle cellule staminali mesenchimali. Inoltre, suggeriamo che il hDPSCs sono un eccellente modello sperimentale per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari del processo di differenziamento neuronale di MSCs.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da "Fondazione Varrone" e Hub di Università di Rieti "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) ristampato con il permesso dell'editore Taylor & Francis Ltd da: complesso multimolecolare di ruolo del Prion protein-EGFR durante il differenziamento neuronale della polpa dentale umane cellule staminali. Martellucci, S., Manganelli V., C. Santacroce, F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei Prion. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
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