Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging
Summary
Tensione di integrina svolge i ruoli importanti in varie funzioni cellulari. Con un sensore di tensione integrativa, integrina tensione è calibrato con sensibilità picoNewton (pN) e ripreso a risoluzione di submicron.
Abstract
Molecolare tensione trasmessa dal ligando integrinico obbligazioni è il segnale meccanico fondamentale nella via dell’integrina che gioca un ruolo importante in molte funzioni cellulari e comportamenti. Per calibrare e integrina tensione della battuta con forza elevata sensibilità e risoluzione spaziale, abbiamo sviluppato un sensore di tensione integrativa (ITS), un sensore di tensione fluorescente basati sul DNA. L’ITS viene attivato per essere flourescente se sostenere una tensione molecolare, così convertire forza segnale fluorescente a livello molecolare. La soglia di tensione per l’attivazione di ITS è accordabile nell’intervallo di pN 10 – 60 che ben copre la gamma dinamica della tensione delle integrine in cellule. Su un substrato innestato con un ITS, la tensione di integrin di cellule aderenti è visualizzata tramite fluorescenza ed imaged a risoluzione di submicron. L’ITS è anche compatibile con formazione immagine strutturale delle cellule in cellule vive e cellule fissate. L’ITS è applicato con successo per lo studio della contrazione delle piastrine e migrazione cellulare. Questa carta in dettaglio la procedura per la sintesi e l’applicazione dell’ITS nello studio della forza cellulare integrina-trasmessa.
Introduction
Le cellule si basano sulle integrine di aderire ed esercitano forze cellulare alla matrice extracellulare. Trasmissione di adesione e forza di integrina-mediata delle cellule sono cruciali per cella diffusione1,2, migrazione3,4e sopravvivenza5,6,7. A lungo termine, integrina biomeccanico segnalazione influenza anche cellula proliferazione8,9,10 e differenziazione11,12. I ricercatori hanno sviluppato diversi metodi per misurare e cellulare di integrina-trasmessa mappa forze all’interfaccia cellula-matrice. Questi metodi sono basati su substrato elastico13, matrice di micropost14, o atomico forza microscopia (AFM)15,16. Elastico substrato e micropost metodi si basano sulla deformazione di substrati per segnalare lo stress cellulare e hanno limitazioni in termini di risoluzione spaziale e forzare la sensibilità. AFM ha forza elevata sensibilità, ma non può rilevare la forza in più punti contemporaneamente, rendendo difficile la mappa cellulare forza trasmessa da integrine.
Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate per studiare la forza cellulare a livello molecolare. Un insieme di sensori di tensione molecolare basato su polietilene glicole17,18, ragno seta peptide19e DNA20,21,22,23 sono stati sviluppati per visualizzare e monitorare la tensione trasmessa dalle proteine molecolari. Tra queste tecniche, DNA fu adottato come il materiale di sintesi nella tensione gauge tether (TGT), un linker rupturable che modula il limite superiore delle tensioni delle integrine in cellule vive22,24. Più tardi, tecnica di trasferimento di risonanza di fluorescenza e di DNA sono stati combinati per creare tornante sensori basati sul DNA fluorescente tensione prima gruppo23 di Chen e gruppo20 di Salaita. Il sensore di tensione basati sul DNA tornante segnala integrina tensione in tempo reale e ha applicato con successo per lo studio di una serie di funzioni cellulari21. In seguito, laboratorio di Wang combinato un TGT con la coppia di fluorophore-quencher per tensione di integrin di relazione. Questo sensore è denominato un ITS25,26. L’ITS è basato sul DNA a doppia elica (dsDNA) e ha una gamma dinamica più ampia (pN 10-60) per la calibrazione di tensionamento di integrina. A differenza dei sensori basati sul DNA di tornante, l’ITS non segnala forza cellulare in tempo reale ma registra tutti gli eventi di integrina storico come l’impronta della forza cellulare; Questo processo di accumulazione di segnale migliora la sensibilità per forza cellulare imaging, rendendo così possibile alla forza cellulare immagine anche con un microscopio a fluorescenza di fascia bassa. La sintesi dell’ITS è relativamente più conveniente in quanto è creato da ibridare due DNAs singola elica (ssDNA).
L’ITS è un dsDNA 18-base-accoppiato coniugato con biotina, un fluoroforo e un quencher (buco nero Quencher 2 [BHQ2])27un ciclico arginylglycylaspartic acido (RGD) peptide28 come un ligando di peptide integrina (Figura 1). Il filo inferiore è coniugato con il fluoroforo (Cy3 è usato in questo manoscritto, mentre altri coloranti, come serie di Cy5 o Alexa, inoltre sono stati dimostrati fattibile nel nostro laboratorio) e il tag di biotina, con cui l’ITS è immobilizzato su un substrato di legame biotina-avidina. Il filo superiore è coniugato con il peptide RGD e il Quencher di buco nero, che disseta Cy3 con circa 98% dissetante efficienza26,27. Con il protocollo presentato in questa carta, la densità di rivestimento dell’ITS su un substrato è circa 1.100/µm2. Questa è la densità che abbiamo precedentemente tarati per 18 bp biotinilati dsDNA rivestito sul substrato neutrAvidin-funzionalizzate seguendo lo stesso protocollo29del rivestimento. Quando le cellule aderiscono al substrato rivestito con l’ITS, integrina associa l’ITS attraverso RGD e trasmette tensione per l’ITS. L’ITS ha una tolleranza di tensione specifico (Ttol) che è definita come la soglia di tensione che separa meccanicamente il dsDNA dell’ITS entro 2 s22. SUA rottura da integrina tensione conduce alla separazione del quencher dal colorante che successivamente emette fluorescenza. Di conseguenza, la tensione di integrina invisibile viene convertita in un segnale di fluorescenza e la forza di cellulare possa essere mappata da formazione immagine di fluorescenza.
Per illustrare l’applicazione dell’ITS, utilizziamo pesce del keratocyte qui, un modello ampiamente usato cella per cella migrazione Studio30,31,32, CHO-K1 cellulare, una linea cellulare immobili comunemente utilizzati e dei fibroblasti NIH 3T3. Coimaging delle strutture di tensione e cella di integrina è anche condotto.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ITS è un altamente accessibile ma potente tecnica per cellulare mappatura in termini sia di sintesi e di applicazione della forza. Tutti i materiali pronti, l’ITS può essere sintetizzato entro 1 giorno. Durante gli esperimenti, sono necessari solo tre passaggi di rivestimento superficiale prima della placcatura di cella. Recentemente, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura di rivestimento per un passo collegando direttamente il suo di albumina di siero bovino, che consente di adsorbimento fisico diretto dell…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal fondo di avvio fornito da Iowa State University e dal National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Referências
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